Geïnduseerde rat lewer S9 -fraksie: 'n Metaboliese aktiveringstelsel vir in vitro genotoksisiteit en mutasietoetse

Sleutelwoorde: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, mutasietoets, genotoksisiteit, genetiese toksisiteit, geïnduseerde rotlewer S9, Ames -toets, mini Ames -toets, chromosomale afwyking, mikronukleus, HPRT/HGPRT -toets, TK -toets

IPhase -produk

Bekendstelling

Geïnduseerde rotlewer S9is 'n sleutelkomponent in die beoordeling van diegenetiese toksisiteitPotensiaal van chemikalieë, veral in regulatoriese toksikologie. Dit word gereeld gebruik in kombinasie met in vitro -ondersoeke, soos dieAMES -toets enmutasietoetse, om die mutageniese eienskappe van verbindings te evalueer. Deur ensiematiese stelsel ryk aan sitochroom P450 (CYP450) te verskaf, speel die geïnduseerde rotlewer S9 -fraksie 'n belangrike rol in die simulering van die metaboliese prosesse wat in die lewer voorkom, wat help om te bepaal of chemikalieë moontlik genetiese mutasies of kanker kan veroorsaak.

Geïnduseerde rotlewer S9

Die lewer S9 -fraksie verwys na 'n pos - mitochondriale supernatant verkry van rotte lewerhomogenate na 'n reeks sentrifugasietappe. Die term "geïnduseerde" verwys na die behandeling van rotte met spesifieke verbindings wat die aktiwiteit van lewerensieme verbeter, veral die sitochroom P450 -ensieme (CYP450), wat verantwoordelik is vir die metabolisme van 'n wye verskeidenheid xenobioties.

Die geïnduseerde rat lewer S9 -fraksie bevat 'n verskeidenheid ensieme wat betrokke is by die fase I en fase II -metabolisme van chemikalieë. Dit sluit ensieme soos sitochroom P450 monooxygenases in, wat oksidatiewe biotransformasie van substraat vergemaklik en sodoende die menslike lewermetabolisme naboots.

CYP450 -aktiwiteit en metaboliese aktivering

Die sitochroom P450 -ensiemfamilie (CYP450) speel 'n belangrike rol in die metabolisme van 'n wye verskeidenheid stowwe, waaronder baie farmaseutiese produkte, omgewingschemikalieë en karsinogene. Die geïnduseerde rotlewer S9 -fraksie bevat hierdie ensieme en is noodsaaklik vir die evaluering van chemikalieë wat slegs genotoksies kan word na metaboliese aktivering.

Baie verbindings is aanvanklik nie giftig nie, maar kan giftig raak na metabolisme in die lewer. Hierdie pro - mutagene (wat metaboliese aktivering benodig om mutagenies te word) en pro - karsinogene (wat aktivering benodig om kanker te veroorsaak) kan slegs opgespoor word deur toetse wat 'n S9 -metaboliese aktiveringstelsel insluit. Sonder die induksie van metaboliese ensieme soos CYP450, kan hierdie stowwe onskadelik wees in standaard genotoksisiteitstoetse.

Deur geïnduseerde rotte lewer S9 by in vitro -ondersoeke toe te voeg, kan navorsers bepaal hoe 'n stof met die CYP450 -ensieme in wisselwerking is. Dit is veral belangrik vir farmaseutiese produkte, aangesien metabolisme deur CYP450 -ensieme 'n kritieke stap is in die farmakokinetika van baie medisyne.

Toepassings van geïnduseerde rotlewer S9

1. 1. AMES -toets (OECD 471)

Die Ames -toets, soos uiteengesit in riglyneOECD 471, is een van die mees bekende en algemeen gebruikte metodes om mutagenisiteit te beoordeel. Dit behels die blootstelling van stamme van Salmonella -bakterieë aan 'n toetschemikalie om te sien of dit mutasies veroorsaak wat veroorsaak dat die bakterieë na 'n histidien -onafhanklike toestand terugkeer.

Om die menslike metaboliese proses te simuleer, word geïnduseerde rotte lewer S9 dikwels by die toetsstelsel gevoeg. Die S9 -fraksie bied die nodige ensieme, insluitend CYP450, wat nodig mag wees om die verbinding in 'n meer reaktiewe vorm te metaboliseer wat mutasies in die bakteriële DNA kan veroorsaak. Hierdie kombinasie van S9 met die AMES -toets maak voorsiening vir 'n meer omvattende assessering van mutageniese potensiaal deur beide direkte en metabolies geaktiveerde mutageniese meganismes na te boots.

2. 2.Mutasietoetse (chromosomale afwykingstoets, mikronukleus -toets en ander in vitro -ondersoeke)

Benewens die AMES -toets, word mutasietoetse gereeld gebruik om die genotoksiese potensiaal van chemikalieë te evalueer. Hierdie toetse is meer omvattend in die beoordeling van 'n reeks genetiese skade, insluitend chromosomale mutasies, geenmutasies en die vorming van mikronukleie. Geïnduseerde rat lewer S9 word om die volgende redes in mutasietoetse gebruik:

Micronucleus -toets (OECD 487)

Hierdie toets bespeur die vorming van mikronukleie in selle, wat klein, ekstranukleêre liggame is wat fragmente van chromosome of hele chromosome bevat wat nie tydens die selafdeling in die kern opgeneem is nie. Die Mikronukleus -toetskan clastogeniese (chromosoom - breek) en anegeniese (wat die chromosoomgetal) effekte opspoor. Geïnduseerde rat lewer S9 word hier gebruik om die toetsstof metabolies te aktiveer, aangesien sommige chemikalieë slegs chromosomale skade veroorsaak sodra dit deur lewerensieme gemetaboliseer is. Die S9 -fraksie verhoog die sensitiwiteit van die toets deur die metaboliese aktivering wat in vivo kan voorkom, te simuleer.

Chromosomale afwykingstoets (OECD 473)

Hierdie toets evalueer of 'n stof strukturele skade aan chromosome kan veroorsaak deur onderbrekings, skrapping, translokasies of ander soorte afwykings te veroorsaak. Soos die mikronukleus -toets, dieChromosomale afwykingstoetskan toegepas word met of sonder metaboliese aktivering. Geïnduseerde ratlewer S9 word by die toetsstelsel gevoeg om die metaboliese prosesse in die lewer na te boots, waardeur die stowwe wat nie chromosomale skade in hul oorspronklike vorm kan veroorsaak nie, maar dit kan doen na lewermetabolisme.

Tabel 1. Vergelykende oorwegings van mutasietoetse

HPRT/HGPRT -toets (OECD 476)

In dieHPRT/HGPRT -toets, Kulture van Chinese hamster (CHO of V79) of menslike limfoblastoïde (TK6) selle word blootgestel aan die toetschemikalie in die teenwoordigheid van 'n geïnduseerde rotlewer S9 metaboliese mengsel, wat CYP450 -ensieme benodig om pro -mutagene in DNA -reaktiewe spesies te omskep. Na 'n kort behandeling en 'n uitdrukkingsperiode van sewe dae, word selle met 6 -tioguanien uitgedaag; Slegs klone wat mutasies met verlies -van -funksie in die hipoksantien -guanien fosforibosieltransferase -geen dra, oorleef oorleef. Deur die vergelyking van mutante kolonies met algehele lewensvatbaarheid, bepaal navorsers 'n mutasiefrekwensie wat, indien reproduceerbaar verhoog word oor gelyktydige en historiese kontroles, genotoksiese potensiaal aandui.

TK -ondersoeke (OECD 490 & OECD 476)

DieTK -toets Gebruik L5178y muis limfoom selle (OECD 490) of CHO -selle (OECD 476) Gemaakte heterosigoties by die Thymidine Kinase -lokus. Na chemiese blootstelling ± S9 -mengsel herstel selle en word dit in medium wat trifluorotimidien bevat, geplateer, wat TK -winsgewende selle doodmaak. Oorlewende TK⁻ -mutante vorm kolonies oor 10-14 dae, met klein -koloniese mutante wat dikwels chromosomale gebeure weerspieël en groot -kolonie -mutante wat puntmutasies weerspieël. Soos in die HPRT/HGPRT -toets, verseker streng sitotoksisiteitskontroles en positiewe mutageen -maatstawwe dat die waargenome toename in mutasiefrekwensie betroubaar die genotoksiese risiko van 'n verbinding weerspieël.

4. 4. Kankerrisiko -assessering

Geïnduseerde rat lewer S9 word ook gebruik in studies wat daarop gemik is om die kanker te beoordeel - wat die potensiaal van stowwe veroorsaak. Deur die metaboliese prosesse wat in die menslike lewer voorkom, te simuleer, kan die S9 -fraksie help om verbindings te identifiseer wat kan lei tot die vorming van reaktiewe metaboliete wat aan DNA kan bind en mutasies kan veroorsaak wat tot kanker kan lei.

Verbeterde Ames -toets met geïnduseerde hamster lewer S9

Volgens die jongste riglyne wat deur die European Medicines Agency (EMA) uitgereik is, is die tradisionele Ames -toets moontlik nie sensitief genoeg om die mutageniese potensiaal van sekere N -nitrosamien -onsuiwerhede op te spoor nie, veral Nitrosodimetylamine (NDMA). Daarom word die verbeterde Ames -toets, ontwikkel deur die National Centre for Toxicological Research (NCTR), 'n afdeling van die Amerikaanse voedsel- en dwelmadministrasie (FDA), aanbeveel as 'n meer betroubare alternatief. Die verbeterde Ames -toets het die toevoeging van die geïnduseerde hamster -lewer S9 bekendgestel, wat uitgevoer is in 30% rotte lewer S9 en 30% hamster lewer S9. Rat- en hamster -desmosomale supernatante (S9's) moet berei word uit knaagdierlewers wat behandel word met sitochroom P450 -ensiem - induserende stowwe. Deur gebruik te maak van geïnduseerde hamster lewer S9, simuleer hierdie verbeterde toets beter metabolisme en verhoog dit die betroubaarheid van die resultate.

Konklusie

Geïnduseerde ratlewer S9 dien as 'n kritieke hulpmiddel in genotoksisiteitstoetsing, wat navorsers en regulerende agentskappe help om die mutageniese en karsinogene potensiaal van chemikalieë te beoordeel. Deur 'n metaboliese aktiveringstelsel te verskaf, verhoog dit die vermoë van ondersoeke soos die Ames -toets, mutasietoetse en CYP450 -aktiwiteitstudies om stowwe op te spoor wat metaboliese aktivering vereis om genotoksies te word. Die toepassings daarvan is noodsaaklik om die veiligheid van nuwe medisyne, chemikalieë en verbruikersprodukte te verseker. Met die rol daarvan in die simulering van menslike lewermetabolisme, is die geïnduseerde rotlewer S9 -fraksie steeds 'n onontbeerlike deel van die moderne toksikologie en regulatoriese veiligheidsbeoordelings.