Першасныя гепатацыты: найважнейшы інструмент для прасоўвання не - клінічных даследаванняў наркотыкаў in vitro

Першасныя гепатацыты: найважнейшы інструмент для прасоўвання не - клінічных даследаванняў наркотыкаў in vitro

Печань, у якасці асноўнага органа для ўздзеяння наркотыкаў, гуляе вырашальную ролю ў метабалізме лекі і таксічнасці. Першасныя гепатацыты валодаюць поўным спектрам клеткавых характарыстык і фізіялагічных узроўняў ферментаў і кафактараў, уключаючы мембрану - звязаныя ферменты, такія як цытахром Р450 (змешаны - функцыянальны оксидазу ў гладкім эндаплазмічным рэтыкулуме) і цытазалічны эстэраза, што складае ўсе шляхі метабалічнага шляху. Па гэтай прычыне першасныя гепатацыты шырока разглядаюцца як залаты стандарт для пабудовы мадэляў печані ў прабірцы і аддаюць перавагу даследчыкам узаемадзеянні з наркотыкамі, метабалізмам лекаў і таксічнасці. У гэтым артыкуле прадстаўлены агляд 2D і 3D -культурных мадэляў, заснаваных на першасных гепатацытах і іх прымяненні ў галіне распрацоўкі наркотыкаў.

Ключавыя словы: першасныя гепатацыты, 2D вырошчванне, 3D -вырошчванне, арганоіды, CO - культура.

1. 1. Вылучэнне першасных гепатацытаў

Вылучэнне першасных гепатацытаў з'яўляецца найважнейшым этапам усталявання мадэляў печані ў прабірцы, прычым найбольш часта выкарыстоўваецца метад перфузіі калагеназы з двума - этап. У меншых жывёл перфузія печані можа праводзіцца з дапамогай мернай вены або ніжняй поверы, у той час як буйныя жывёлы звычайна патрабуюць перфузіі праз долі печані і сегментаў. Некалькі ключавых фактараў уплываюць на паспяховую вылучэнне гепатацытаў: па -першае, калагеназа павінна быць не - цытастатычнай. Па -другое, тэрміны стрававання маюць вырашальнае значэнне -як пад - страваванне, так і праз - страваванне можа паставіць пад пагрозу выхад і жыццяздольнасць гепатацытаў. Па -трэцяе, стан печані павінна быць аптымальным, бо гепатацыты вельмі адчувальныя да ішэмічнага пашкоджання. Печань, якая выкарыстоўваецца для падрыхтоўкі гепатацытаў, трэба хутка астуджаць, каб знізіць хуткасці абмену рэчываў і прадухіліць метабалічную гіпаксію і наступную ішэмію.

Стандарты першасных гепатацытаў, якія выкарыстоўваюцца ў даследаванні наркотыкаў, наступныя:

1. 2. Першасная 2D культура гепатацытаў

Мадэль гепатацытаў падвескі

Ён змяшчае поўны наркотык - метабалізуючы ферменты і кафактары, што робіць яго прыдатным для вывучэння розных шляхоў метабалічнага ачысткі. Аднак жыццяздольнасць гепатацытаў завісі і актыўнасць лекі - метабалізуючы ферменты паступова памяншаюцца па меры павелічэння часу інкубацыі in vitro, абмяжоўваючы час інкубацыі да максімум 4 гадзін. Звычайна гэтая мадэль выкарыстоўваецца для ацэнкі афармлення лекаў з умераным і высокім узроўнем афармлення. Калі хуткасць афармлення менш за 20%, дакладныя значэнні афармлення немагчыма вызначыць. Традыцыйныя гепатацыты падвескі - на аснове мадэляў метабалізму ў прабірцы недастаткова для атрымання выяўленых метабалічных рэакцый для павольных - метабалізацыі злучэнняў, што абмяжоўвае іх здольнасць прадказваць хуткасць афармлення і метабалічныя прадукты гэтых злучэнняў. Для пашырэння часу інкубацыі можна выкарыстоўваць метад рэле гепатацытаў (малюнак 1) для пашырэння інкубацыі да 20 гадзін і нават больш.

Прыкладанне:Актыўнасць ферментаў і даследаванні метабалічнай устойлівасці для дробных малекулярных прэпаратаў.

Малюнак 1. Працэс перадачы метаду пераносу гепатацытаў падвескі

Крыніца: наркотыкі Metab Dispos, 2012,40 (9): 1860–1865

Мадэль платных гепатацытаў

Першасныя гепатацыты культывуюцца ў 2D -сістэме на пласцінах Collagen - з пакрыццём. У гепатацытах выяўляецца эпітэліяльная марфалогія, з выступоўцамі ядраў, якія часта прадстаўляюцца ў двухкутнай форме. Недахопы аднаслойнай культуры аднаслаёвай гепатацытаў ўключаюць: 1. Змена палярнасці клетак і функцыі.2. Адсутнасць іншых адпаведных тыпаў клетак (г.зн. не - парэнхімальных клетак), неабходных для нармальнай функцыі.3. Немагчымасць забяспечыць дастатковую колькасць пажыўных рэчываў і паракрынных фактараў для падтрымкі гепатацытаў пры выкананні сваіх функцый (напрыклад, біясінтэз бялку жоўцевай кіслаты і сыроваткі).

Прыкладанні:

1). Ацэнка наркотыкаў - Узаемадзеянне з наркотыкамі:Сюды ўваходзяць індукцыя ферментаў, прыгнёт ферментаў і даследаванні транспарцёраў. Па -першае, калі прэпарат дзейнічае як індуктар, гэта можа прывесці да ўзмацнення экспрэсіі лекі - метабалізацыі ферментаў і транспарцёраў. Моцныя індуктары могуць адначасова рэгуляваць некалькі генаў, напрыклад, фенабарбіталу CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT і некалькі транспартных бялкоў, як MRP2. Па -другое, існуюць віды - канкрэтныя адрозненні ў тым, як гепатацыты рэагуюць на індуктары. Напрыклад, рифампицин з'яўляецца эфектыўным індуктарам для гепатацытаў чалавека і труса, але не аказвае індукцыйнага ўплыву на гепатацыты пацукоў. Нарэшце, неаптымальная шчыльнасць пакрыцця платных гепатацытаў можа прывесці да зніжэння базальнай экспрэсіі P450 і штучна павышаных індукцыйных рэакцый. Як паказана на малюнку 3, гепатацыты пры меншай шчыльнасці пакрыцця паказваюць больш нізкую базальную актыўнасць CYP1A2, CYP2B6 і CYP3A4, але больш моцныя індукцыйныя рэакцыі. Такім чынам, для атрымання фізіялагічна значных дадзеных неабходныя здаровыя гепатацыты пры адпаведнай шчыльнасці пакрыцця.

Малюнак 2. Узаемасувязь паміж шчыльнасцю пакрыцця криоконсервированных гепатацытаў і індукцыяй ферментаў

Крыніца: Цяперашнія тэхналогіі выяўлення наркотыкаў, 2010, 7: 188 - 198

2). Ацэнка гепатотоксичности: Назіранне за марфалагічнымі зменамі пад светлавым мікраскопам, напрыклад, марфалогіяй клетак, вакуола і агрэгацыяй кропель ліпідаў і мацаваннем/адслаеннем клетак. Выяўленне некрозу гепатацытаў (як паказана аспартатам амінатрансферазай, лактат -дэгідрагеназай і аланінам амінатрансферазай) і апоптозам (фрагментацыя ДНК). Для цітокіна - апасродкаванай цітотоксичности, адзінкавыя аднаслаёвыя культуры гепатацытаў не могуць прадказаць таксічныя рэакцыі з -за рэгулявання рэчывамі, якія вылучаюцца з суседніх не - парэнхімальных клетак, такіх як клеткі купфера, зорныя клеткі і сінусоідныя эндотелиальныя клеткі.

3). "Метад рэле" для вывучэння павольнай метабалізацыі злучэння і яго метабалітаў: Актыўнасць лекі - метабалізуючы ферменты ў платных гепатацытах пачынае памяншацца пасля 24 гадзін пакрыцця. Пасля інкубацыі платных гепатацытаў з сыроваткай - свабоднай асяроддзя, якая змяшчае злучэнне, якое цікавіць на працягу 24 гадзін, серада збіраюць і змешваюць, затым пераносяць у новыя планаваныя гепатацыты для далейшага даследавання (мал. 3).

Малюнак 3. Працэс перадачы метадаў рэле платаванага гепатацытаў

Крыніца: Лісты метабалізму наркотыкаў, 2016, 10: 3 - 15

3). Ацэньвайце клеткавае паглынанне, эндацытоз, эндасомальнае ўцёкі і замоўчванне эфектаў на мэтавы ген гепатацытаў - мэтанакіраваныя дробныя ябл -кіслаты.

Мадэль вырошчвання сэндвіча

У прабірцы гепатацыты можна культывавацца паміж двума пластамі калагена або матрыгеля, каб аднавіць структуры in vivo, вядомы як вырошчванне сэндвіча. Гепатацыты, культываваныя паміж двума пластамі геля - калагена (бутэрбродная структура), могуць палепшыць марфалогію і жыццяздольнасць клетак і падтрымліваць іх функцыянальнасць на працягу больш доўгага перыяду. Акрамя таго, гепатацыты ў культуры сэндвіча могуць аднавіць палярнасць, што дазваляе правільнай лакалізацыі базалатэральных і каналізацыйных транспарцёраў, а таксама ўтварэнне функцыянальных сетак жоўцевых пратокаў (мал. 4).

Малюнак 4. Палярызаваная экспрэсія транспарцёраў у мадэлі сэндвіча -гепатацытаў чалавека

Крыніца: Цяперашнія тэхналогіі выяўлення наркотыкаў, 2010, 7, 188 - 198

Прыкладанні:

1. 1). Ацэнка жоўцевых вывядзенняў злучэнняў.
2. 2). Ацэнка пячоначнага і жоўцевага размеркавання эндагенных і экзагенных злучэнняў і метабалітаў.
3. 3). Ацэнка афармлення, апасродкаванага метабалізмам і транспарцёрамі, і пабудова фізіялогіі - Фармакокінетычныя мадэлі на аснове.
4. 4). Вывучэнне гепатотоксичности і забяспечваючы механізмы клінічнага прэпарата - індукаванае пашкоджанне печані. Дадзеныя інтэграваны ў сістэмныя мадэлі фармакалогіі для прагназавання патэнцыяльных прэпаратаў - індукаванага пашкоджання печані ў чалавека.
5.  
   1. 3. Першасная 3D -культура гепатацытаў

6. У 3D -культурных сістэмах гепатацыты культывуюцца ў трохмернай матрыцы, якая лепш імітуе архітэктуру печані in vivo ў параўнанні з 2D аднаслойных культур. Гэтыя сістэмы спрыяюць клеткавай і клеткавай і матрычнай узаемадзеянням, якія могуць аднавіць больш фізіялагічных функцый печані, уключаючы метабалізм лекаў, сакрэцыю бялку і фарміраванне жоўці. Першасныя 3D -культуры гепатацытаў могуць быць выкарыстаны для вывучэння печані - Спецыфічныя функцыі ў больш у натуральных умовах - як навакольнае асяроддзе, прапаноўваючы перавагі для тэставання на наркотыкі, ацэнку таксічнасці і мадэлявання захворванняў.

   Сфероідная мадэль

З дапамогай такіх метадаў, як ультра - культура з нізкай прыхільнасцю, культура падвеснай кроплі і культура магнітнай клеткі (мал. 5), першасныя гепатацыты могуць аб'яднацца ў сфероідныя агрэгаты дыяметрам да 150 - 175 мкм, не абапіраючыся на знешнія матрыцы. Адной з пераваг сфероіднай культуры з'яўляецца тое, што кожнаму сфероіду патрабуецца толькі 1330 - 2000 клетак, што значна зніжае колькасць клетак у параўнанні з іншымі метадамі 3D -культуры. Апошнія даследаванні паказалі, што першасныя сфероідныя культуры гепатацытаў могуць падтрымліваць да 5 тыдняў, а актыўнасць ферментаў CYP застаецца амаль нязменнай паміж 8 -й і 35 -м днём. Аналіз пратэёмікі паказаў, што ў параўнанні з культурай сэндвіча, ферменты, якія адказваюць за паглынанне наркотыкаў, распаўсюджванне, метабалізм і вывядзенне, лепш захоўваюцца для 14 дзён у культуры шфіруіда. Аднак печань значна складаней, чым клеткавы агрэгат. Базалатэральная бок гепатацытаў узаемадзейнічае з крывёй, у той час як жоўць выцякае з верхавіннай бакі, што з'яўляецца ключавой асаблівасцю складанай структуры долі печані, і гэта яшчэ не можа быць паўтараецца ў сфероіднай мадэлі.

Прыкладанні:

1. 1). Вывучэнне павольнага метабалізацыі злучэння і яго метабалітаў.
2. 2). Даследаванне гепатотоксичности.
3. 3). Ацэнка клеткавага паглынання, эндацытозу, эндасомальнага ўцёкаў і замоўчвання ўздзеяння на мэтавыя гены гепатацытаў - мэтанакіраваныя дробныя нуклеінавыя прэпараты.

Малюнак 5. Спосаб сфероіднай культуры

Мадэль арганоідаў печані

Вызначэнне кансенсусу арганоідаў: 3D -структуры, атрыманыя са ствалавых клетак, клетак -папярэднікаў або дыферэнцыраваных клетак, здольных прайграваць пэўныя функцыі і структуры роднай тканіны in vitro, эфектыўна імітуючы мікраасяроддзе ў натуральных умовах і клетках у - узаемадзеяння клетак. Арганоіды печані былі вызначаны як самая перадавая мадэль даследаванняў біялогіі печані чалавека.

Крыніцы клетак для арганоіднай канструкцыі печані:

① плюрипотентныя ствалавыя клеткі (PSC):

Эмбрыянальныя ствалавыя клеткі (ESC) і выкліканыя плюрипотентныя ствалавыя клеткі (IPSC) валодаюць высокай плюрипотентности, пластычнасці і неабмежаванай праліфератыўнай здольнасцю. Пад уплывам спецыфічных сігнальных фактараў яны дыферэнцыруюцца ў гепатацыты - як клеткі з актыўнасцю і функцыяй. Аднак арганоіды печані, атрыманыя з ПСК, могуць перанесці эпігенетычныя і генетычныя змены, выяўляючы змены храмасомных анеўплоіды пры ўзмацненні.

Прыкладанні:

1. 1). Генетычныя мадэлі захворванняў печані
2. 2). Інфекцыйныя мадэлі захворванняў печані
3. 3). Тэставанне на цытастатычнасць лекаў

② Атрыманыя клеткі печані - Сюды ўваходзяць халангіёцыты і гепатацыты. Спелыя гепатацыты захоўваюць патэнцыял ствалавых клетак і праліфератыўную здольнасць у пэўных умовах. У параўнанні з PSC - атрыманыя арганоіды, арганоіды, атрыманыя з першаснай тканіны, больш сталыя, з больш устойлівымі геномамі і падтрымліваюць фенатыпічную і генетычную стабільнасць на працягу доўгага - тэрмін у прабірцы. Аднак доўгая - тэрмін праліфератыўнай здольнасці спелых гепатацытаў чалавека абмежаваная ў параўнанні з гепатацытамі плёну чалавека або першаснымі гепатацытамі дарослых мышы. Вырошчванне арганоідаў гепатацытаў для дарослых застаецца складанай задачай.

Метад культуры (мал. 6): тканіна печані пераварваецца ў адзінкавыя клеткі, а сумесь матрыгеля і клетак высейваецца ў 24 -й пласціне, утвараючы купал - форму. Інкубат у інкубатары клеткавай культуры (37 ° С) на працягу 15 хвілін. Пасля застывання дадайце пэўную культуру. Праход праз прыблізна 14 дзён. Замяніце арыгінальную сераду дыферэнцыяцыяй праз 7 - 10 дзён.

Прыкладанні:

1. 1). Гепатотоксичность мадэлі
2. 2). Даследаванні расстройства метабалізму ў прабірцы ў прабірцы
3. 3). Не - спіртная тлушчавая хвароба печані
4. 4). Распрацоўка лекаў для дабраякасных і злаякасных захворванняў печані

Малюнак 6. Працэс культуры і праходжання тканіны - Выведзеныя арганоіды печані

Крыніца: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

Параўнанне сфероіднай культуры і арганоіднай культуры

4. Першасны гепатацытар CO - Мадэль культуры

1. 1. 2D асноўны гепатацытар CO - Мадэль культуры
      

      У 2D першаснай гепатацытавай мадэлі культуры два і больш розных тыпаў клетак змешваюцца і культывуюцца ў двухмернай асяроддзі. Ключавой асаблівасцю гэтай мадэлі з'яўляецца непасрэднае ўзаемадзеянне паміж рознымі тыпамі клетак, узаемадзеяннем клетак і пазаклеткавай матрыцай, альбо ўскоснай перадачай сігналу праз цітокіны і хімічную сувязь. Першасныя функцыі гепатацытаў, такія як вытворчасць альбуміна і здольнасці да метабалізму наркотыкаў, могуць захоўвацца да трох тыдняў.

      Прыкладанні:

      1. 1). Першасныя гепатацыты CO - культывуюцца з фібрабластамі: гэтая мадэль выкарыстоўваецца для вывучэння хуткасці клірансу павольных - метабалізацыі злучэнняў і іх метабалітаў.
      2. 2). Першасныя гепатацыты CO - культывуюцца з не - парэнхімальнымі клеткамі печані (напрыклад, зорчатымі клеткамі, сінусоідальнымі эндотелиальнымі клеткамі): гэтая мадэль карысная для даследавання лекі - выкліканых пашкоджаннем печані (DILI), бо дапамагае даследаваць ролю цітокіны, хемокіны і фактары росту пры мадулюючых адаптыўных рэакцыях печані пасля ўздзеяння наркотыкаў.
      3. 3). Першасныя гепатацыты CO - культывуюцца з Т -клеткамі: гэтая мадэль выкарыстоўваецца для выяўлення метабалізму печані - Спецыфічныя Т -клеткавыя рэакцыі.
      4. 4). Hepatomax ™ iPhaseCo - Сістэма культуры: iPhase распрацавала сумесную сістэму культуры з першаснымі гепатацытамі з розных відаў, вядомых як гепатомакс™. З дапамогай CO - культываванне першасных гепатацытаў чалавека са стромальнымі клеткамі, можна падтрымліваць добрыя прэпараты - метабалізацыя актыўнасці ферментаў у гепатацытах чалавека на працягу 3 тыдняў. Гэтая сістэма падыходзіць для вывучэння павольнай - метабалізацыі складаных хуткасцей і іх метабалітаў.

      Гэтая мадэль CO - культура забяспечвае больш фізіялагічна значную платформу для ацэнкі метабалізму, таксічнасці і печані - звязаных з імі захворванняў, прапаноўваючы разуменне таго, як розныя тыпы клетак спрыяюць функцыі печані і хваробам.
      
      

      3D -першасны гепатацытар CO - Мадэль культуры

      Прамая 3D CO - культура: Гэтая мадэль прадугледжвае змешванне двух ці больш розных тыпаў клетак печані (напрыклад, першасных гепатацытаў, сінусоідных эндотелиальных клетак, пячоначных зорных клетак, клетак купфера), якія ўтвараюць сябе - сабраныя сфероіды альбо СО - культываванне іх у 3D -асяроддзі, пабудаваныя з такімі матэрыяламі, як калаген, фібран, алганат, альбо гідрагелі. Прамая 3D Co - Культура дазваляе цесна ўзаемадзейнічаць паміж рознымі клеткамі печані праз механізмы, такія як клетка - да - адгезіі клетак, паракрынную сігналізацыю з дапамогай растваральных цітокіны і адгезіі пазаклеткавай матрыцы, што дазваляе мець зносіны паміж гепатацытамі.

      Прыкладанні:

      1. 1). Мадэль фіброзу печані: выкарыстоўваецца для вывучэння механізмаў і прагрэсавання фіброзу печані.
      2. 2). Мадэль траўмы печані (DILI), выкліканая лекам, дапамагае імітаваць і ацаніць пашкоджанне печані, выкліканае лекамі.
      3. 3). Узаемадзеянне з наркотыкамі, метабалізм наркотыкаў і індукцыя ферментаў: ацэньвае, як розныя лекі ўзаемадзейнічаюць, як яны метаболізуюцца і як яны выклікаюць ферменты печані.

      Ускосны 3D Co - культура: Гэты метад выкарыстоўвае сістэму фізічнага аддзялення (напрыклад, Transwell або іншыя матэрыялы) для культуры двух і больш тыпаў клетак (напрыклад, першасных гепатацытаў з клеткамі NIH/3T3 або сінусоідальнымі эндотелиальнымі клеткамі) у 3D -асяроддзі, дзе прадухіляецца прамая клетка - да - кантакт з клеткамі. Сувязь паміж клеткамі адбываецца з дапамогай растваральных цітокіны.

      Прыкладанні:
      Выкарыстоўваецца для вывучэння не - кантактнай сувязі паміж клеткамі печані ў арганізме.

      
      Такім чынам, iPhase, як лідэр у біялагічных даследаваннях in vitro, забяспечвае ўсебаковыя рашэнні для не - клінічнага тэставання на наркотыкі. Ад ізаляцыі і культуры першасных гепатацытаў ад розных відаў да распрацоўкі прадуктаў, якія падтрымліваюць, такія як культурныя сродкі масавай інфармацыі для канкрэтных прымянення або шматкарыстальніцкай калагена Мы давераным партнёрам для кліентаў у фармацэўтычнай прамысловасці, імкнучыся забяспечыць рэжучыя - Edge Solutions для не - клінічных даследаванняў.