Първични хепатоцити: решаващ инструмент за усъвършенстване на не - клинични in vitro изследвания на лекарството

Първични хепатоцити: решаващ инструмент за усъвършенстване на не - клинични in vitro изследвания на лекарството

Черният дроб, като основен орган за експозиция на лекарства, играе решаваща роля в метаболизма на лекарството и процесите на токсичност. Първичните хепатоцити притежават пълния спектър от клетъчни характеристики и физиологични нива на ензими и кофактори, включително мембрана - свързани ензими като цитохром Р450 (смесена - Функционална оксидаза в гладката ендоплазмен ретикулум) и цитозолни естеразни естеразни естерази, които обхващат всички метаболни пътища. Поради тази причина първичните хепатоцити се считат за златен стандарт за изграждане на in vitro чернодробни модели и са предпочитани от изследователите в лекарственото взаимодействие, метаболизма на лекарството и изследванията на токсичността. Тази статия предоставя преглед на 2D и 3D културни модели, базирани на първични хепатоцити и техните приложения в развитието на лекарствата.

Ключови думи: първични хепатоцити, 2D отглеждане, 3D отглеждане, органоиди, CO - култура.

1. 1. Изолиране на първичните хепатоцити

Изолирането на първичните хепатоцити е критична стъпка за установяване на in vitro чернодробни модели, като най -често се използва най -често използваният метод на перфузия на колагеназа. При по -малки животни, чернодробната перфузия може да се извършва чрез порталната вена или долната вена кава, докато по -големите животни обикновено изискват перфузия чрез чернодробни лобове или сегменти. Няколко ключови фактора влияят на успешната изолация на хепатоцитите: първо, колагеназата трябва да бъде не - цитотоксична. Второ, времето на храносмилането е от решаващо значение -Както под - храносмилане, така и над - храносмилането могат да компрометират добива и жизнеспособността на хепатоцитите. Трето, чернодробното състояние трябва да бъде оптимално, тъй като хепатоцитите са силно чувствителни към исхемично увреждане. Черният дроб, използван за подготовка на хепатоцити, трябва бързо да се охлажда, за да се намалят метаболитните скорости и да се предотврати метаболитна хипоксия и последваща исхемия.

Стандартите за първични хепатоцити, използвани в изследванията на лекарствата, са следните:

1. 2. Първична хепатоцитна 2D култура

Моделът на хепатоцитите на суспензията

Той съдържа пълно лекарство - метаболизиращи ензими и кофактори, което го прави подходящ за изучаване на различни пътища на метаболитен клирънс. Въпреки това, жизнеспособността на хепатоцитите на суспензията и активността на лекарството - метаболизиращи ензими постепенно намаляват с увеличаването на времето за инкубация in vitro, ограничавайки времето за инкубация до максимум 4 часа. Този модел обикновено се използва за оценка на изчистването на лекарства с умерена до висока степен на клирънс. Когато степента на клирънс е по -малка от 20%, не могат да се определят точни стойности на клирънс. Традиционните суспензионни хепатоцити - Моделите на метаболизма in vitro са недостатъчни за генериране на откриваеми метаболитни реакции за бавни - метаболизиращи съединения, като по този начин ограничават способността им да прогнозират скоростта на клирънс и метаболитните продукти на тези съединения. Методът на релето на хепатоцитите на суспензия (Фигура 1) може да се използва за удължаване на времето на инкубация до 20 часа или дори по -дълго.

Приложение:Ензимна активност и проучвания за метаболитна стабилност за лекарства с малки молекули.

Фигура 1. Процес на трансфер

Източник: Drug Metab Dissuct, 2012,40 (9): 1860–1865

Платимият модел на хепатоцитите

Първичните хепатоцити се култивират в 2D система на колаген - Покрити културни плочи. Хепатоцитите проявяват епителна морфология, с изпъкнали ядра, често представящи се в бинуклеирана форма. Недостатъците на монослойната култура на единична хепатоцити включват: 1. Промяна на клетъчната полярност и функция.2. Липса на други съответни типове клетки (т.е. не - паренхимни клетки), които са необходими за нормална функция.3. Невъзможността да се осигурят достатъчно хранителни вещества и паракринни фактори за поддържане на хепатоцитите при изпълнение на техните функции (като биосинтеза на жлъчна киселина и серумен протеин).

Приложения:

1). Оценка на лекарството - Взаимодействия с лекарства:Това включва ензимна индукция, инхибиране на ензима и изследвания на транспортиране. Първо, когато лекарството действа като индуктор, това може да доведе до повишена експресия на лекарствени метаболизиращи ензими и транспортиращи. Силните индуктори могат да регулират едновременно множество гени, като фенобарбитална индукция на CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT и няколко транспортни протеина като MRP2. Второ, има видове - Специфични разлики в начина, по който хепатоцитите реагират на индукторите. Например, рифампицинът е ефективен индуктор за човешки и заешки хепатоцити, но няма индукционен ефект върху хепатоцитите на плъхове. И накрая, субоптималната плътност на покритието на платичните хепатоцити може да доведе до намалена базална експресия на p450s и изкуствено повишени индукционни реакции. Както е показано на фигура 3, хепатоцитите при по -ниска плътност на покритие показват по -ниска базална активност на CYP1A2, CYP2B6 и CYP3A4, но по -силни индукционни отговори. Следователно, за получаване на физиологично значими данни са необходими здрави хепатоцити при подходяща плътност на покритие.

Фигура 2. Връзка между плътността на покритие на криоконсервирани човешки хепатоцити и индукция на ензима

Източник: Текущи технологии за откриване на лекарства, 2010, 7: 188 - 198

2). Оценка на хепатотоксичност: Наблюдавайки морфологични промени при лек микроскоп, като клетъчна морфология, вакуола и агрегация на липидни капчици и прикрепване/откъсване на клетките. Откриване на хепатоцитна некроза (както е показано от аспартат аминотрансфераза, лактатна дехидрогеназа и аланин аминотрансфераза) и апоптоза (ДНК фрагментация). За цитокини - медиирана цитотоксичност, единичните монослойни култури на хепатоцитите не могат да предскажат токсични отговори поради регулацията на вещества, освободени от съседни не - паренхимни клетки, като клетки на Kupffer, стелатни клетки и синусоидални ендотелиални клетки.

3). „Метод на реле“ за изследване на бавен метаболизиращ съединен клирънс и неговите метаболити: Активността на лекарството - метаболизиращи ензими в платими хепатоцити започва да намалява след 24 часа покритие. След инкубиране на платични хепатоцити със серум - свободна среда, съдържаща съединението, което представлява интерес за 24 часа, средата се събира и смесва, след което се прехвърля в нови платични хепатоцити за по -нататъшно изследване (Фигура 3).

Фигура 3. Платен процес на прехвърляне на метод на хепатоцитни релета

Източник: Писма на метаболизма на лекарството, 2016, 10: 3 - 15

3). Оценете клетъчното усвояване, ендоцитозата, ендозомното бягство и заглушаващите ефекти върху целевия ген на хепатоцитите - насочени малки лекарства с нуклеинова киселина.

Модел за отглеждане на сандвич

In vitro, хепатоцитите могат да бъдат култивирани между два слоя колаген или матригел за реконструкция in vivo структури, известни като култивиране на сандвич. Хепатоцитите, култивирани между два слоя гел - колаген (сандвич структура), могат да подобрят морфологията и жизнеспособността на клетките и да поддържат функционалността си за по -дълъг период. Освен това, хепатоцитите в сандвич културата могат да възстановят полярността, което позволява правилната локализация на базолатерални и каналални преносители, както и образуването на функционални мрежи на жлъчните пътища (Фигура 4).

Фигура 4. Поляризирана експресия на преносители в модела на сандвич на човешки хепатоцити

Източник: Текущи технологии за откриване на лекарства, 2010, 7, 188 - 198

Приложения:

1. 1). Оценка на жлъчната екскреция на съединения.
2. 2). Оценка на чернодробното и жлъчно разпределение на ендогенни и екзогенни съединения и метаболити.
3. 3). Оценка на клирънс, медииран от метаболизъм и преносители, и конструиране на физиология - базирани на фармакокинетични модели.
4. 4). Изучаване на хепатотоксичност и осигуряване на механизми за клинично лекарство - индуцирано увреждане на черния дроб. Данните са интегрирани в системните фармакологични модели за прогнозиране на потенциалното лекарство - Индуцирано увреждане на черния дроб при хора.
5.  
   1. 3. Първична хепатоцитна 3D култура

6. В 3D културни системи хепатоцитите се култивират в три - размерена матрица, която по -добре имитира in vivo чернодробната архитектура в сравнение с 2D монослойните култури. Тези системи насърчават клетките - Клетъчни и клетъчни - матрични взаимодействия, които могат да възстановят повече от физиологичните функции на черния дроб, включително метаболизма на лекарството, секрецията на протеини и образуването на жлъчка. Първичните 6D култури на хепатоцитите могат да се използват за изучаване на черния дроб - специфични функции в по -in vivo - Подобна среда, предлагащи предимства за тестване на лекарства, оценка на токсичността и моделиране на заболявания.

   Сфероиден модел

Чрез техники като ултра - култура с ниска привързаност, култура на висяща капка и магнитна клетъчна култура (Фигура 5), първичните хепатоцити могат да се агрегират в сфероидни агрегати с диаметър до 150 - 175 µm, без да се разчитат на външни матрици. Едно предимство на сфероидната култура е, че всеки сфероид изисква само 1330 - 2000 клетки, което значително намалява броя на клетките в сравнение с други 3D техники за култура. Последните проучвания показват, че първичните сфероидни култури на хепатоцитите могат да поддържат до 5 седмици, като CYP ензимната активност остава почти непроменена между 8 -ия ден и 35 -ия ден. Анализът на протеомиката разкрива, че в сравнение със сандвич културата са по -добре, отговорни за усвояването на лекарства, разпространението, метаболизма и експресията са по -добре запазени за 14 дни в сфероидна култура. Въпреки това, черният дроб е много по -сложен от клетъчния агрегат. Базолатералната страна на хепатоцитите взаимодейства с кръвта, докато жлъчката изтича от апикалната страна, която е ключова характеристика на сложната структура на чернодробните лобули и това все още не може да бъде възпроизведено в сфероидния модел.

Приложения:

1. 1). Проучване на бавен метаболизиращ съединен клирънс и неговите метаболити.
2. 2). Изследване на хепатотоксичност.
3. 3). Оценка на клетъчното усвояване, ендоцитозата, ендозомното бягство и заглушаващите ефекти върху целевите гени на хепатоцитите - насочени малки лекарства с нуклеинова киселина.

Фигура 5. Метод на сфероидна култура

Модел на чернодробна органоиди

Дефиницията на консенсус на органоидите е: 3D структури, получени от стволови клетки, прогениторни клетки или диференцирани клетки, способни да възпроизвеждат определени функции и структури на естествената тъкан in vitro, ефективно имитирайки in vivo микроезеролежната среда и клетъчните взаимодействия. Чернодробните органоиди са идентифицирани като най -напредналият модел за изследване на биологията на черния дроб на човека.

Клетъчни източници за чернодробно организиране на органоиди:

Pluripotent стволови клетки (PSCs):

Ембрионалните стволови клетки (ESCs) и индуцираните плюрипотентни стволови клетки (IPSC) притежават висока плюрипотентност, пластичност и неограничен пролиферативен капацитет. Под въздействието на специфични сигнални фактори те се разграничават в хепатоцит - като клетки с активност и функция. Въпреки това, чернодробните органоиди, получени от PSCs, могат да претърпят епигенетични и генетични промени, проявяващи хромозомни анеуплоидични промени по време на амплификация.

Приложения:

1. 1). Модели на генетични чернодробни заболявания
2. 2). Модели на инфекциозни чернодробни заболявания
3. 3). Тестване на цитотоксичност на лекарството

② Чернодробна тъкан - Производни клетки: Те включват холангиоцити и хепатоцити. Зрелите хепатоцити запазват потенциал на стволови клетки и пролиферативна способност в специфични среди. В сравнение с PSC - получени органоиди, органоидите, получени от първичната тъкан, са по -зрели, с по -стабилни геноми и поддържат фенотипна и генетична стабилност по време на дълга - термин in vitro култура. Дългият - термин пролиферативен капацитет на зрели човешки хепатоцитни органоиди е ограничен в сравнение с феталните човешки хепатоцити или първичните хепатоцити на мишката при възрастни. Култивирането на органоидите на хепатоцитите при възрастни остава предизвикателство.

Метод на културата (Фигура 6): Чернодробната тъкан се усвоява в единични клетки и смес от матригел и клетки се засява в 24 - кладенци за образуване на купол - образувани структури. Инкубирайте в инкубатор на клетъчна култура (37 ° С) в продължение на 15 минути. След втвърдяване добавете специфична културална среда. Преминаване след приблизително 14 дни. Сменете оригиналната среда с среда за диференциация след 7 - 10 дни.

Приложения:

1. 1). Модели на хепатотоксичност
2. 2). Проучвания за разстройство на метаболизма in vitro
3. 3). Не - алкохолни мастни чернодробни заболявания
4. 4). Развитие на лекарствата за доброкачествени и злокачествени чернодробни заболявания

Фигура 6. Процес на култура и преминаване на тъканите - получени чернодробни органоиди

Източник: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

Сравнение на сфероидна култура и органоидна култура

4. Основен Hepatocyte Co - културен модел

1. 1. 2D първичен Hepatocyte Co - културен модел
      

      В 2D първичния модел на Hepatocyte Co - културата два или повече различни типове клетки се смесват и култивират в две - размерена среда. Ключовата характеристика на този модел е директното взаимодействие между различните типове клетки, взаимодействието между клетките и извънклетъчната матрица или предаването на индиректния сигнал чрез цитокини и химически комуникации. Първичните функции на хепатоцитите, като производството на албумин и способността за метаболизъм на лекарството, могат да се поддържат до три седмици.

      Приложения:

      1. 1). Първични хепатоцити CO - култивирани с фибробласти: Този модел се използва за изучаване на скоростта на клирънс на бавни - метаболизиращи съединения и техните метаболити.
      2. 2). Първични хепатоцити CO - култивирани с не - паренхимни чернодробни клетки (например, звездни клетки, синусоидални ендотелни клетки): Този модел е полезен за изследване на лекарството - индуцирано увреждане на черния дроб (DILI), тъй като помага да се изследва ролята на цитокините, хемокините и растежните фактори при модулиране на чернодробните адаптивни реакции след излагане на лекарства.
      3. 3). Първични хепатоцити CO - култивирани с Т клетки: Този модел се използва за откриване на метаболизъм на чернодробните лекарства - Специфични Т -клетъчни отговори.
      4. 4). Iphase's Hepatomax ™CO - Културна система: Iphase е разработила CO - културна система с първични хепатоцити от различни видове, известни като хепатомакс™. Чрез CO - култивиране на човешки първични хепатоцити със стромални клетки е възможно да се поддържат добро лекарство - метаболизираща ензимна активност в човешки хепатоцити до 3 седмици. Тази система е подходяща за изучаване на бавни - метаболизиращи скорости на клирънс и техните метаболити.

      Този модел на CO - културата осигурява по -физиологично значима платформа за оценка на лекарствения метаболизъм, токсичност и чернодробни - свързани болестни процеси, предлагайки представа за това как различните видове клетки допринасят за функцията на черния дроб и болестта.
      
      

      3D първичен Hepatocyte Co - културен модел

      Директна 3D CO - Култура: Този модел включва смесване на два или повече различни видове чернодробни клетки (например, първични хепатоцити, синусоидални ендотелни клетки, чернодробни звездни клетки, Kupffer клетки), за да се образуват самостоятелно - сглобени сфероиди или CO - култивиране в 3D среда, изградени с материали като колагени, фибрин, алгинат, или хидрогели. Директната 3D CO - културата позволява тясно взаимодействие между различни чернодробни клетки чрез механизми като клетка - до - клетъчна адхезия, паракринна сигнализация чрез разтворими цитокини и адхезия на извънклетъчната матрица, което позволява комуникация между хепатоцитите.

      Приложения:

      1. 1). Модел на чернодробната фиброза: Използва се за изследване на механизмите и прогресирането на чернодробната фиброза.
      2. 2). Лекарство - Индуциран модел на увреждане на черния дроб (DILI): Помага за симулиране и оценка на увреждането на черния дроб, причинено от лекарства.
      3. 3). Взаимодействията между лекарствата, метаболизма на лекарството и индуцирането на ензима: оценяват как взаимодействат различните лекарства, как се метаболизират и как индуцират чернодробни ензими.

      Индиректна 3D CO - Култура: Този метод използва физическа система за разделяне (например Transwell или други материали), за да културата два или повече вида клетки (като първични хепатоцити с NIH/3T3 клетки или синусоидални ендотелни клетки) в 3D среда, където се предотвратява директната клетка - към - към клетъчния контакт. Комуникацията между клетките възниква чрез разтворими цитокини.

      Приложения:
      Използва се за изучаване на не - контактна комуникация между чернодробните клетки в тялото.

      
      В обобщение, афазата като лидер в биологичните изследвания in vitro предоставя цялостни разтвори за не - клинични тестове за лекарства. От изолацията и културата на първичните хепатоцити от различни видове до разработването на поддържащи продукти като културна среда за специфични приложения или многократно - спецификационни колаген - покрити плочи, Iphase е посветен на предлагането на най -добрите in vitro изследователски инструменти за откриване и развитие на лекарството. Ние сме надежден партньор за клиенти във фармацевтичната индустрия, ангажиран да предостави резки - крайни решения за не - клинични изследвания.