Primarni hepatociti: ključni alat za napredovanje ne - kliničke in vitro istraživanja droga

Primarni hepatociti: ključni alat za napredovanje ne - kliničke in vitro istraživanja droga

Jetra, kao primarni organ za izloženost droga, igra ključnu ulogu u metabolizmu metabolizma i toksičnosti. Primarni hepatociti posjeduju puni spektar mobilnih karakteristika i fiziološke razine enzima i kofaktora, uključujući membranu - vezane za citohrom P450 (mješovita - funkcija oksida u glatkom endoplazmatskom retikulumu) i citosoličke esteraze, obuhvaćaju sve metaboličke puteve pronađene u jetri. Iz tog razloga, primarni hepatociti široko se smatraju zlatnim standardom za izgradnju in vitro modela jetre i favoriziraju ih istraživači u interakciji lijekova, metabolizmu lijekova i studija toksičnosti. Ovaj članak pruža pregled 2D i 3D modela kulture zasnovane na primarnim hepatocitima i njihovim primjenama u razvoju lijekova.

Ključne riječi: primarni hepatociti, 2D kultivacija, 3D kultivacija, organoidi, co - kultura.

1. 1. Izolacija primarnih hepatocita

Izolacija primarnih hepatocita kritični je korak u uspostavljanju in vitro modela jetre, s kolekcionazom od strane - najčešće se najčešće koristi. U manjim životinjama, perfuzija jetre može se izvesti putem portalne vene ili inferiorne Vene Cava, dok veće životinje obično zahtijevaju perfuziju kroz lanice ili segmente jetre. Nekoliko ključnih faktora utječe na uspješnu izolaciju hepatocita: prvo, kolagenaza bi trebala biti ne - citotoksična. Drugo, vreme probave je presudno-I pod - probavom i prekomjerne vatre mogu ugroziti prinos i održivost hepatocita. Treće, stanje jetre mora biti optimalno, jer su hepatociti vrlo osjetljivi na ishemijsku štetu. Jetra koja se koristi za pripremu hepatocita treba se brzo ohladiti kako bi se smanjila metaboličke cijene i sprečavaju metaboličku hipoksiju i naknadnu ishemiju.

Standardi za primarne hepatocite koji se koriste u istraživanju droga su sljedeći:

1. 2. Primarna hepatocita 2D kultura

Model ovjesa HEPATOCYTE

Sadrži kompletnu drogu - metabolizirajuće enzime i kofaktore, čineći ga pogodnim za proučavanje različitih metaboličkih staza. Međutim, održivost suspenzije Hepatociti i djelatnost droge - Postepe se postepeno smanjenje enzima metabolizirajući kao vrijeme inkubacije u intubaciji, ograničavajući vrijeme inkubacije na najviše 4 sata. Ovaj se model obično koristi za procjenu čišćenja lijekova umjerenim do visokih stopa carine. Kada je stopa čišćenja manja od 20%, precizne vrijednosti odobrenja ne mogu se utvrditi. Tradicionalni suspenzija Hepatocyte - modeli na vitrom metabolizma su nedovoljni za stvaranje otkrivajućih metaboličkih reakcija za sporo - metabolizirajuće spojeve, čime se ograničavaju njihovu sposobnost predviđanja stope odobrenja i metaboličkih proizvoda ovih spojeva. Metoda releja ovjesa HEPATOCYTE (slika 1) može se koristiti za produženje vremena inkubacije na 20 sati ili još duže.

Primjena:Enzimska aktivnost i metabolička studija stabilnosti za male molekule lijekove.

Slika 1. Proces prenosa ovjesnog hepatocita prijenosa releja

Izvor: Raspolozi metabi od droge, 2012,40 (9): 1860-1865

Model gornjih hepatocita

Primarni hepatociti kultivirani su u 2D sustavu na kolagenu - kulturnim pločicama obloženim kulturom. Hepatociti pokazuju epitelnu morfologiju, sa izbočenim jezgrama, često predstavljajući u kanti za kaninu. Nedostaci jedinstvene kulture monolaja za jednu hepatocit uključuju: 1. Izmjena polariteta i funkcije ćelije.2. Nedostatak drugih relevantnih vrsta ćelija (I.E., ne - parenhimne ćelije) koje su potrebne za normalnu funkciju.3. Nemogućnost pružanja dovoljnih hranjivih sastojaka i faktora parakrarina kako bi podržali hepatocite u obavljanju svojih funkcija (poput bile kiseline i biosinteza proteina u serumu).

Primjene:

1). Evaluacija lijekova - Interakcije lijekova:To uključuje indukciju enzima, inhibicije enzima i studije transportera. Prvo, kada droga djeluje kao indukter, može dovesti do povećanog izražavanja lijekova - metaboliziranje enzima i transportera. Snažni indukci mogu istovremeno naručiti više gena, poput fenobarbitalne indukcije CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT i nekoliko transportnih proteina poput MRP2. Drugo, postoje vrste - specifične razlike u tome kako hepatociti odgovaraju na induktere. Na primjer, Rifampicin je efikasan indukter za ljudske i zečeve hepatocite, ali nema indukcijskog učinka na hepatocite štakora. Konačno, suboptimalna gustoća ploča od gornjih hepatocita može dovesti do smanjenog bazalnog izražavanja P450-a i umjetno povećanih indukcijskih odgovora. Kao što je prikazano na slici 3, hepatociti na nižim gustoćima pločice prikazuju nižu bazalnu aktivnost CYP1A2, CYP2B6 i CYP3A4, ali jače indukcijske odgovore. Stoga su potrebni zdravi hepatociti u odgovarajućoj gustini za oblaganje za dobivanje fiziološki relevantnih podataka.

Slika 2. Odnos između prekrivanja gustoće križevanih ljudskih hepatocita i indukcije enzima

Izvor: Trenutna tehnologija otkrivanja droga, 2010, 7: 188 - 198

2). Procjena hepatotoksičnosti: Promatranje morfoloških promjena pod laganim mikroskopom, poput morfologije ćelijske morfologije, usavršavanje i lipida, i pričvršćivanje ćelija / odreda. Otkrivanje nekroze hepatocita (kako je naznačeno aspartatom aminotransferazom, laktatom dehidrogenazom i alanine aminotransferazom) i apoptozom (fragmentacija DNK). Za citokine - posredovane citotoksičnosti, pojedinačne monolačne kulture hepatocita ne mogu predvidjeti toksične odgovore zbog propisa tvari koje se oslobađaju iz susjednih ne - parenhimskih stanica, poput Kupffer ćelija, i sinusoidnih endotelnih ćelija.

3). "Metoda releja" za proučavanje sporog metaboliziranja složenog razgovora i njenih metaboliti: Djelatnost droge - Metaboliziranje enzima u plobičavom hepatocitima počinje se smanjivati ​​nakon 24 sata obloga. Nakon inkubiranja motornih hepatocita sa serumom - Slobodan medij koji sadrži jedinjenje kamate tokom 24 sata, medij se skuplja i miješa, a zatim se prebacuje na nove gornji hepatociti za dalju studiju (slika 3).

Slika 3. Proces prenosa metode releja za vitrine Hepatocite

Izvor: Pisma metabolizma lijekova, 2016, 10: 3 - 15

3). Procijenite stanični unos, endocitozu, endosalni bijeg i utišate efekte na ciljni gen hepatocita - ciljali su male nukleinske lekove.

Model obrade sendviča

In vitro, hepatociti se mogu kultivirati između dva sloja kolagena ili matrigela za rekonstrukciju u vivo konstrukcijama, poznatim kao uzgoj sendviča. Hepatociti kultivirani između dva sloja gela - kolagena (sendvič strukture) mogu poboljšati morfologiju i održivost ćelija i održavati svoju funkcionalnost na duži period. Nadalje, hepatociti u sendvič kulturi mogu vratiti polaritet, omogućavajući pravilnu lokalizaciju basolateralnih i kanalikularnih prevoza, kao i formiranje funkcionalnih žučnih kanala (slika 4).

Slika 4. Polarizirani izraz prevoza u modelu sendviča u ljudskom hepatocitu

Izvor: Trenutna tehnologija otkrivanja droga, 2010, 7, 188 - 198

Primjene:

1. 1). Procjena bilijarnog izlučivanja spojeva.
2. 2). Procjena jetrene i bilijarne distribucije endogenih i egzogenih spojeva i metabolita.
3. 3). Procjena čišćenja posredovana metabolizmom i transportere i izgradnja fiziologije - farmakokinetičkih modela.
4. 4). Proučavanje hepatotoksičnosti i pružanje mehanizama za klinički lijek - ozljeda jetre. Podaci su integrirani u modele farmakologije sistema za predviđanje potencijalnog lijeka - ozljeda jetre kod ljudi.
5.  
   1. 3. Primarna hepatocita 3D kultura

6. U 3D kulturnim sistemima, hepatociti se sadrže u tri - dimenzionalnu matricu, što je bolje oponašalo u vivojskoj arhitekturi u odnosu na 2D monolayer kulture. Ovi sustavi promoviraju ćeliju - ćelije i ćelije - matrične interakcije, koje mogu vratiti više fizioloških funkcija jetre, uključujući metabolizam droge, izlučivanje proteina i oblikovanje. Primarni HEPATOCYTE 3D kulture mogu se koristiti za studiranje specifičnih funkcija - u vivo-u u vivo - kao što je okoliš, nudeći prednosti za ispitivanje lijekova, procjenu toksičnosti i modeliranje bolesti.

   Sferoid model

Kroz tehnike kao što su ultra - kultura sa niskim pričvršćivanjem, viseći kulturu pad i magnetna ćelija (slika 5), ​​primarni hepatociti mogu se ugraditi u sferoidne agregate promjera do 150 - 175 μm bez oslanjanja na vanjske matrice. Jedna prednost sferoidne kulture je da svaki sferoid zahtijeva samo 1.330 - 2.000 ćelija, značajno smanjujući broj ćelija u odnosu na druge tehnike 3D kulture. Nedavne studije su pokazale da se primarna HEPATOCYTE sferoidna kultura mogu održati do 5 tjedana, a CYP enzimna aktivnost je ostala gotovo nepromijenjena između 8. i 3. dana. U odnosu na sendvič kulturu, enzimima odgovorna za apsorpciju droga, razdjelci, metabolizam i izlučivanje bolje sačuvati 14 dana u sferoidnoj kulturi. Međutim, jetra je mnogo složenija od stanične agregate. Baolateralna strana hepatocita djeluje krvlju, dok se žuč teče sa apikalne strane, što je ključna karakteristika složene strukture lobule jetre, a to se još ne može replicirati u sferoidnom modelu.

Primjene:

1. 1). Proučavanje sporog metaboliziranja složenog odobrenja i njegovih metabolita.
2. 2). Istraživanje hepatotoksičnosti.
3. 3). Evaluacija ćelijskog ublažavanja, endocitoze, endosomalnog bijega i utikača na ciljne gene hepatocita - ciljali su male nukleinske lekove.

Slika 5. Metoda sferoidne kulture

Model jetrenog organoida

Definicija konsenzusa je: 3D strukture izvedene iz matičnih ćelija, predloga ćelija ili različitih ćelija, sposobne reproducirati određene funkcije i strukture izvornog tkiva u vitro, efikasno oponašaju interakciju u vivo u vivou. Organoidi jetre identificirani su kao najnapredniji model za istraživanje biologije ljudske jetre.

Cell izvori za izgradnju organoidne jetre:

① Pluripotentne matične ćelije (PSC):

Embrionalne matične ćelije (ESCS) i inducirane pluripotentne matične stanice (IPSCS) posjeduju visoku pljuskove, plastičnost i neograničen proliferativni kapacitet. Pod utjecajem specifičnih signalnih faktora, oni razlikuju u hepatocite - poput ćelija sa aktivnostima i funkcijom. Međutim, organoidi jetre dobiveni iz PSC-a mogu se podvrgnuti epigenetičkim i genetskim izmjenama, izlagajući hromosomalne aneuploidne promjene tijekom pojačanja.

Primjene:

1. 1). Modeli genetske bolesti jetre
2. 2). Infektivni modeli bolesti jetre
3. 3). Ispitivanje citotoksičnosti na drogu

② Tkiva jetre - Izvedene ćelije: Oni uključuju cholangiocite i hepatocite. Zreli hepatociti zadržavaju potencijal matičnih ćelija i proliferativne sposobnosti u određenim okruženjima. U odnosu na PSC - izvedene organoide, organoidi izvedeni iz primarnog tkiva su zreliji, sa stabilnijim genomima i održavaju fenotipnu i genetsku stabilnost tokom dugotrajne poruke u vitro kulturi. Međutim, dugi rok - proliferativni kapacitet zrelog ljudskog hepatocita Orgatoida je ograničen u odnosu na fetalne ljudske hepatocite ili mišem za odrasle primarne hepatocite. Kulturiranje odraslih hepatocita Orgonti ostaje izazovan.

Metoda kulture (Slika 6): tkivo jetre probavljeno je u pojedinačne ćelije, a mješavina matrigela i ćelija se zasijava u 24 - dobroj ploči da formiraju građevine u obliku kupole. Inkubirajte u inkubatoru ćelijske kulture (37 ° C) 15 minuta. Nakon učvršćivanja, dodajte specifična kulturna medija. Odlomak nakon otprilike 14 dana. Zamijenite izvorni medij s diferencijacijskim medijima nakon 7 - 10 dana.

Primjene:

1. 1). Hepatotoksičnost Modeli
2. 2). Studije poremećaja poremećaja metabolizma
3. 3). Non - alkoholna bolest jetrene jetre
4. 4). Razvoj lijekova za benigrene i maligne bolesti jetre

Slika 6. Kultura i prolazak procesa tkiva - izvedenih organoida jetre

Izvor: ćelija i bioznanost (2023) 13: 197

Poređenje sferoidne kulture i organoidne kulture

4. Primarni model kulture Hepatocyte Co -

1. 1. 2D primarni hepatocyte co - Model kulture
      

      U 2D primarnom modelu kulture HEPATOCYTE CO - Dvije ili više različitih vrsta ćelija miješaju se i kultivirani u dvojici - dimenzionalnom okruženju. Ključna karakteristika ovog modela je izravna interakcija između različitih tipova ćelija, interakcije između ćelija i ekstracelularne matrice ili indirektnog mjenjača signala putem citokina i hemijske komunikacije. Primarne funkcije hepatocita, kao što su sposobnost proizvodnje algumina i metabolizma droge, mogu se održavati do tri tjedna.

      Primjene:

      1. 1). Primarni hepatociti CO - Uzgajanje sa fibroblastima: Ovaj model se koristi za proučavanje brzine klirensa sporih - metabolizirajućih spojeva i njihovih metaboliti.
      2. 2). Primarni hepatociti Co - Uzgajani sa - parenhimnim ćelijama jetre (npr. Sinusoidne endotelne ćelije): Ovaj model je koristan za istraživanje povrede jetre -, jer pomaže u istraživanju uloga citokina, hemokina i rasta u modulaciji adaptivnih odgovora na moduliranju.
      3. 3). Primarni hepatociti CO - Uzgajani sa T ćelijama: Ovaj model se koristi za otkrivanje metabolizma lijekova jetre - specifičnih odgovora na TEL.
      4. 4). Iphase's HepatoMax ™Co - Kulturni sistem: Iphase je razvio sistem kulture Co - sa primarnim hepatocitima iz različitih vrsta, poznatih kao hepatomax™. Autor Co - Kulturiranje ljudskih primarnih hepatocita sa Stromalnim ćelijama, moguće je održavati dobar lijek - metaboliziranje enzimske aktivnosti u ljudskim hepatocitima za do 3 tjedna. Ovaj sustav je pogodan za proučavanje sporih - stope složenih razgovora i njihovih metabolita.

      Ovaj model kulture Co - pruža fiziološki relevantnu platformu za procjenu metabolizma lijekova, toksičnosti i jetre i jetre - srodnih procesa bolesti, nudeći uvid u koliko različitih vrsta ćelija doprinose funkciji i bolesti jetre.
      
      

      3D primarni hepatocit Co - Model kulture

      Direktno 3D Co - Kultura: Ovaj model uključuje miješanje dvije ili više različitih vrsta ćelija (npr. Primarni hepatociti, sinusoidne endotelne ćelije, kupffer ćelije) za obrazbu sasvim sastavljaju sfere ili co - u 3D okruženju izgrađenim materijalima, poput kolagena, fibrina, alginata ili hidrogela. Direct 3D CO - Kultura omogućava blisku interakciju između različitih ćelija jetre kroz mehanizme poput ćelije - do - prianjanja stanice, parakrinila, električnim japinama i vanjliranom matricom, omogućavajući komunikaciju između hepatocita.

      Primjene:

      1. 1). Model fibroze jetre: koristi se za proučavanje mehanizama i napredovanja fibroze jetre.
      2. 2). Lijek - Model izazvanog ozljeda jetre (dili): pomaže simulirati i procijeniti štetu jetre uzrokovanu lijekovima.
      3. 3). Interakcije lijekova, metabolizam droge i indukciju enzima: procjenjuje kako različiti lijekovi komuniciraju, kako su metabolizirani i kako induciraju jetrene enzime.

      Indirektni 3D Co - Kultura: Ova metoda koristi fizički sistem odvajanja (npr., Predosjećaj ili druge materijale) za kulturu dvije ili više vrsta ćelija (poput primarnih hepatocita sa NIH / 3T3 ćelijama ili sinusoidnim endotelnim ćelijama) u kojoj se sprečava direktna ćelija - na - kontakt sa - Komunikacija između stanica događa se putem rastvorljivih citokina.

      Primjene:
      Koristi se za proučavanje kontakt komunikacije između ćelija jetre u tijelu.

      
      Ukratko, Iphase kao lider u biološkom istraživanju in vitro pruža sveobuhvatna rješenja za ne - kliničko ispitivanje droga. Iz izoliranja i kulture primarnih hepatocita iz različitih vrsta za razvoj pratećih proizvoda kao što su kulturni mediji za specifične aplikacije ili višestruke specifikacije Kolagen - Iphase je namijenjena ponudi najboljih in vitro istraživačkih alata za otkrivanje i razvoj droga. Mi smo pouzdan partner za klijente u farmaceutskoj industriji, posvećenog pružanju rezanja - ivica za ne - klinička istraživanja.