Hepatòcits primaris: una eina crucial per avançar en la investigació de fàrmacs in vitro no -

Hepatòcits primaris: una eina crucial per avançar en la investigació de fàrmacs in vitro no -

El fetge, com a òrgan principal per a l’exposició a fàrmacs, té un paper crucial en els processos del metabolisme i la toxicitat dels fàrmacs. Els hepatòcits primaris posseeixen tot l’espectre de característiques cel·lulars i nivells fisiològics d’enzims i cofactors, inclosos enzims de membrana - lligats com el citocrom P450 (una funció mixta d’oxidasa en el reticle endoplàsmic suau) i les estèries citosòliques, englobant totes les vies metabòliques que es troben en la fulla. Per aquest motiu, els hepatòcits primaris són àmpliament considerats com a estàndard d'or per construir models hepàtics in vitro i són afavorits pels investigadors en la interacció fàrmac, el metabolisme dels fàrmacs i els estudis de toxicitat. Aquest article proporciona una visió general dels models de cultura 2D i 3D basats en hepatòcits primaris i les seves aplicacions en el desenvolupament de medicaments.

Paraules clau: hepatòcits primaris, cultiu 2D, cultiu 3D, organoids, co -cultura.

1. 1. Aïllament dels hepatòcits primaris

L’aïllament d’hepatòcits primaris és un pas crític per establir models hepàtics in vitro, sent el mètode de perfusió de col·lagenasa de dos passos el més utilitzat. En animals més petits, la perfusió hepàtica es pot realitzar mitjançant la vena portal o la vena cava inferior, mentre que els animals més grans normalment requereixen perfusió a través de lòbuls o segments hepàtics. Diversos factors clau influeixen en l’aïllament amb èxit dels hepatòcits: primer, la col·lagenasa hauria de ser no - citotòxica. En segon lloc, el temps de la digestió és crucial ...Tant a la digestió com a la digestió pot comprometre el rendiment i la viabilitat dels hepatòcits. En tercer lloc, la condició hepàtica ha de ser òptima, ja que els hepatòcits són altament sensibles als danys isquèmics. El fetge utilitzat per a la preparació d’hepatòcits s’ha de refredar ràpidament per reduir les taxes metabòliques i prevenir la hipòxia metabòlica i la posterior isquèmia.

Els estàndards dels hepatòcits primaris utilitzats en la investigació de fàrmacs són els següents:

1. 2. Cultura 2D Hepatòcits primaris

El model de hepatòcits de suspensió

Conté enzims i cofactors metabolitzadors complets de fàrmacs, fent -lo adequat per estudiar diverses vies de depuració metabòlica. Tanmateix, la viabilitat dels hepatòcits de suspensió i l’activitat dels enzims metabolitzadors de fàrmacs disminueixen gradualment a mesura que augmenta el temps d’incubació in vitro, limitant el temps d’incubació a un màxim de 4 hores. Aquest model s’utilitza normalment per estimar la liquidació de fàrmacs amb taxes d’eliminació de moderada a alta. Quan la taxa de depuració és inferior al 20%, no es poden determinar valors precisos. Els models de metabolisme in vitro de la suspensió tradicionals són insuficients per generar reaccions metabòliques detectables per a compostos de metabolització lents, limitant així la seva capacitat de predir les taxes de liquidació i els productes metabòlics d’aquests compostos. Es pot utilitzar un mètode de relé d’hepatòcits de suspensió (figura 1) per ampliar el temps d’incubació a 20 hores o fins i tot més temps.

Aplicació:Activitat enzimàtica i estudis d’estabilitat metabòlica per a fàrmacs de molècules petites.

Figura 1. Procés de transferència del mètode de relé d’hepatòcits de suspensió

Font: Metab Metab Dispos, 2012,40 (9): 1860–1865

El model d’hepatòcits planables

Els hepatòcits primaris es cultiven en un sistema 2D en plaques de cultiu recobertes de col·lagen. Els hepatòcits presenten una morfologia epitelial, amb nuclis sobresortint, sovint presentant -se de forma binucleada. Els inconvenients del cultiu monocapa d’hepatòcits únics inclouen: 1. Alteració de la polaritat i la funció cel·lular.2. Falta d’altres tipus de cèl·lules rellevants (és a dir, cèl·lules no parènquimals) necessàries per a la funció normal.3. La incapacitat per proporcionar nutrients suficients i factors paracrins per donar suport als hepatòcits en la realització de les seves funcions (com ara l’àcid biliar i la biosíntesi de proteïna sèrica).

Aplicacions:

1). Avaluació del medicament - Interaccions del fàrmac:Inclou la inducció enzimàtica, la inhibició dels enzims i els estudis de transportadors. En primer lloc, quan un fàrmac actua com a inductor, pot conduir a una major expressió dels enzims i transportadors de fàrmacs. Els inductors forts poden regular diversos gens simultàniament, com ara la inducció fenobarbital de CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT i diverses proteïnes de transport com MRP2. En segon lloc, hi ha espècies - Diferències específiques en la manera en què els hepatòcits responen als inductors. Per exemple, la rifampicina és un inductor eficaç per als hepatòcits humans i de conill, però no té cap efecte d’inducció sobre els hepatòcits de rata. Finalment, la densitat de placa subòptima d’hepatòcits platables pot conduir a una expressió basal reduïda de P450 i augment de les respostes d’inducció artificialment. Tal com es mostra a la figura 3, els hepatòcits a densitats de xapa més baixes mostren una menor activitat basal de CYP1A2, CYP2B6 i CYP3A4, però respostes d’inducció més fortes. Per tant, són necessaris hepatòcits saludables a una densitat de xapa adequada per obtenir dades rellevants fisiològicament.

Figura 2. Relació entre la densitat de xapat d’hepatòcits humans i inducció enzimàtica

Font: Actual Drug Discovery Technologies, 2010, 7: 188 - 198

2). Avaluació de l'hepatotoxicitat: Observació de canvis morfològics a un microscopi lleuger, com la morfologia cel·lular, l’agregació de gotes de vacúol i lípids i l’aferrament/despreniment cel·lular. Detecció de necrosi d’hepatòcits (tal com s’indica per l’aminotransferasa d’aspartat, el lactat deshidrogenasa i l’aminotransferasa d’alanina) i l’apoptosi (fragmentació d’ADN). Per a la citocina - Citotoxicitat mediada, els cultius monocapa únics d’hepatòcits no poden predir respostes tòxiques a causa del reglament per substàncies alliberades de cèl·lules no parènquimals veïnes, com ara cèl·lules Kupffer, cèl·lules estelades i cèl·lules endotelials sinusoïdals.

3). "Mètode de relé" per a l'estudi de la metabolització lenta la depuració composta i els seus metabòlits: L’activitat dels enzims metabolitzadors de fàrmacs en hepatòcits planables comença a disminuir després de 24 hores de xapa. Després d’incubar hepatòcits platables amb sèrum - medi lliure que conté el compost d’interès durant 24 hores, el medi es recull i es barreja, després es transfereix a nous hepatòcits platables per a un estudi posterior (figura 3).

Figura.

Font: Drug Metabolism Letters, 2016, 10: 3 - 15

3). Avalueu la captació cel·lular, l'endocitosi, la fugida endosòmica i els efectes de silenciament sobre el gen objectiu de l'hepatòcit - Els fàrmacs d'àcid nucleic dirigits.

Model de cultiu de sandvitx

In vitro, els hepatòcits es poden cultivar entre dues capes de col·lagen o matrigel per reconstruir estructures in vivo, conegudes com a cultiu de sandvitx. Els hepatòcits cultivats entre dues capes de col·lagen de gel (estructura sandwich) poden millorar la morfologia i la viabilitat de les cèl·lules i mantenir la seva funcionalitat durant un període més llarg. A més, els hepatòcits en el cultiu de sandvitx poden restaurar la polaritat, permetent una localització adequada de transportadors basolaterals i canaliculars, així com la formació de xarxes de conductes biliars funcionals (figura 4).

Figura 4. Expressió polaritzada dels transportadors en el model sandvitx d’hepatòcits humans

Font: Actual Drug Discovery Technologies, 2010, 7, 188 - 198

Aplicacions:

1. 1). Estimació de l'excreció biliar de compostos.
2. 2). Avaluació de la distribució hepàtica i biliar de compostos i metabòlits endògens i exògens.
3. 3). Estimació de l’autorització mediada pel metabolisme i els transportadors, i la construcció de models farmacocinètics basats en fisiologia.
4. 4). Estudiar hepatotoxicitat i proporcionar mecanismes per a lesions hepàtiques induïdes per fàrmacs clínics. Les dades s’integren en els models de farmacologia dels sistemes per predir lesions potencials de les drogues i lesions hepàtiques induïdes en humans.
5.  
   1. 3. Cultura 3D de l’hepatòcit primari

6. En els sistemes de cultiu 3D, els hepatòcits es cultiven en una matriu de tres dimensions, que imita millor l’arquitectura hepàtica in vivo en comparació amb les cultures de monocapa 2D. Aquests sistemes promouen les interaccions cel·lulars i cel·lulars - matrius, que poden restaurar més de les funcions fisiològiques del fetge, incloses el metabolisme dels fàrmacs, la secreció de proteïnes i la formació de bilis. Es poden utilitzar cultius 3D d’hepatòcits primaris per estudiar funcions del fetge - específiques en un entorn més in vivo -

   Model esferoide

Mitjançant tècniques com el cultiu d’afectació ultra - baix, el cultiu de gota penjat i el cultiu de cèl·lules magnètiques (figura 5), ​​els hepatòcits primaris poden agregar -se en agregats esferoïdals amb un diàmetre de fins a 150 - 175 µm sense confiar en matrius externes. Un dels avantatges del cultiu esferoide és que cada esferoide requereix només 1.330 - 2.000 cèl·lules, reduint significativament el nombre de cèl·lules en comparació amb altres tècniques de cultiu 3D. Estudis recents han demostrat que les cultures esferoides d’hepatòcits primaris poden mantenir -se fins a cinc setmanes, amb l’activitat de l’enzim CYP que es manté gairebé inalterat entre el dia 8 i el dia 35. L’anàlisi de proteòmica va revelar que, en comparació amb el cultiu sandvitx, els enzims responsables de l’absorció de fàrmacs, la distribució, el metabolisme i l’excreció es conserven millor durant 14 dies en el cultiu d’espheroides. Tot i això, el fetge és molt més complex que un agregat cel·lular. El costat basolateral dels hepatòcits interacciona amb la sang, mentre que la bilis surt del costat apical, que és una característica clau de l'estructura complexa del loble hepàtic, i això encara no es pot replicar en el model esferoide.

Aplicacions:

1. 1). Estudi de la lentitud de metabolització de compostos i els seus metabòlits.
2. 2). Recerca en hepatotoxicitat.
3. 3). Avaluació de la captació cel·lular, endocitosi, escapada endosòmica i efectes de silenciament sobre els gens objectiu dels fàrmacs d’àcid nucleic dirigits a l’hepatòcit.

Figura 5. Mètode de cultiu esferoide

Model dels organoides hepàtics

La definició de consens d’organoides és: estructures 3D derivades de cèl·lules mare, cèl·lules progenitores o cèl·lules diferenciades, capaços de reproduir certes funcions i estructures del teixit natiu in vitro, imitant eficaçment les interaccions de microambient in vivo i cèl·lules a les interaccions cel·lulars. Els organoides hepàtics s’han identificat com el model més avançat per a la investigació en biologia hepàtica humana.

Fonts cel·lulars per a la construcció d’organoides hepàtiques:

① Cèl·lules mare pluripotents (PSCs):

Les cèl·lules mare embrionàries (ESCs) i les cèl·lules mare pluripotents induïdes (IPSCs) posseeixen una alta pluripotència, plasticitat i capacitat proliferativa il·limitada. Sota la influència de factors de senyalització específics, es diferencien en hepatòcits com les cèl·lules amb activitat i funció. No obstant això, els organoides hepàtics derivats de PSC poden experimentar alteracions epigenètiques i genètiques, mostrant canvis d’aneuploidia cromosòmica durant l’amplificació.

Aplicacions:

1. 1). Models de malalties hepàtiques genètiques
2. 2). Models infecciosos de malalties hepàtiques
3. 3). Prova de citotoxicitat de fàrmacs

② Teixit hepàtic - Cèl·lules derivades: inclouen colangiòcits i hepatòcits. Els hepatòcits madurs conserven el potencial de cèl·lules mare i la capacitat proliferativa en entorns específics. En comparació amb els organoides derivats de PSC, els organoides derivats del teixit primari són més madurs, amb genomes més estables i mantenen una estabilitat fenotípica i genètica durant el cultiu in vitro llarg. Tanmateix, la capacitat proliferativa de llarg termini dels organoides hepatòcits humans madurs és limitada en comparació amb els hepatòcits humans fetal o els hepatòcits primaris del ratolí adult. El cultiu dels organoides per a hepatòcits adults continua sent un repte.

Mètode de cultiu (figura 6): el teixit hepàtic es digereix en cèl·lules simples, i una barreja de matrigel i cèl·lules es sembren en una placa de 24 - Well per formar estructures en forma de cúpula. Incubeu en una incubadora de cultiu cel·lular (37 ° C) durant 15 minuts. Després de la solidificació, afegiu un medi de cultiu específic. Passatge al cap de 14 dies aproximadament. Substituïu el medi original per un medi de diferenciació després de 7 - 10 dies.

Aplicacions:

1. 1). Models d’hepatotoxicitat
2. 2). Estudis del desordre del metabolisme in vitro
3. 3). Malaltia hepàtica grassa no alcohòlica
4. 4). Desenvolupament de medicaments per a malalties hepàtiques benignes i malignes

Figura 6. Procés de cultiu i pas de teixit - Organoides hepàtics derivats

Font: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

Comparació del cultiu esferoide i del cultiu organoide

4. Model de cultiu de hepatòcits primaris

1. 1. Model de cultiu de hepatòcits 2D 2D
      

      En el model de cultiu de hepatòcits 2D 2D, dos o més tipus de cèl·lules diferents es barregen i es cultiven en un entorn bidimensional. La característica clau d’aquest model és la interacció directa entre diferents tipus de cèl·lules, la interacció entre cèl·lules i la matriu extracel·lular o la transmissió del senyal indirecte mitjançant citocines i comunicacions químiques. Les funcions d’hepatòcits primaris, com la producció d’albúmina i la capacitat del metabolisme dels fàrmacs, es poden mantenir fins a tres setmanes.

      Aplicacions:

      1. 1). Hepatòcits primaris co -cultivats amb fibroblasts: aquest model s’utilitza per estudiar la taxa d’autorització de compostos metabolitzadors lents i els seus metabòlits.
      2. 2). Hepatòcits primaris co -cultivats amb cèl·lules hepàtiques no parènquimals (per exemple, cèl·lules estelades, cèl·lules endotelials sinusoïdals): aquest model és útil per investigar les lesions hepàtiques induïdes per fàrmacs (DILI), ja que ajuda a investigar el paper de les citocines, les quimiocines i els factors de creixement en la modulació de respostes adaptables al fetge després de l’exposició al fàrmac.
      3. 3). Hepatòcits primaris co -cultivats amb cèl·lules T: aquest model s’utilitza per detectar el metabolisme del fàrmac hepàtic - respostes específiques de cèl·lules T.
      4. 4). IPhase's Hepatomax ™CO - Sistema de cultura: iPhase ha desenvolupat un sistema de cultiu de coherència amb hepatòcits primaris de diferents espècies, coneguts com a hepatomax™. Mitjançant el cultiu d’hepatòcits primaris humans amb cèl·lules estromals, és possible mantenir un bon medicament - Metabolitzar l’activitat enzimàtica en hepatòcits humans fins a 3 setmanes. Aquest sistema és adequat per estudiar les taxes de depuració de compostos lents i els seus metabòlits.

      Aquest model de cultiu de co -cultura proporciona una plataforma més fisiològicament rellevant per avaluar el metabolisme dels medicaments, la toxicitat i els processos de malalties relacionades amb el fetge, que ofereixen informació sobre com contribueixen diferents tipus de cèl·lules a la funció hepàtica i a la malaltia.
      
      

      Model de cultiu de hepatòcits 3D 3D

      Direct 3d co - cultura: Aquest model consisteix en barrejar dos o més tipus diferents de cèl·lules hepàtiques (per exemple, hepatòcits primaris, cèl·lules endotelials sinusoïdals, cèl·lules estelades hepàtiques, cèl·lules Kupffer) per formar esferoides autònoms? El cultiu directe 3D permet una interacció estreta entre diferents cèl·lules hepàtiques a través de mecanismes com l’adhesió de cèl·lules - a - cel·lular, la senyalització paracrina mitjançant citocines solubles i l’adhesió de la matriu extracel·lular, que permet la comunicació entre els hepatòcits.

      Aplicacions:

      1. 1). Model de fibrosi hepàtica: utilitzat per estudiar els mecanismes i la progressió de la fibrosi hepàtica.
      2. 2). Model de lesions hepàtiques induïdes per fàrmacs (DILI): ajuda a simular i avaluar els danys hepàtics causats per les drogues.
      3. 3). Les interaccions fàrmacs, el metabolisme dels fàrmacs i la inducció enzimàtica: avalua la interacció de diferents fàrmacs, com es metabolitzen i com indueixen enzims hepàtics.

      CO COULTAT INDIRECTE CO - CULTURA: Aquest mètode utilitza un sistema de separació física (per exemple, Transwell o altres materials) per cultivar dos o més tipus de cèl·lules (com els hepatòcits primaris amb cèl·lules NIH/3T3 o cèl·lules endotelials sinusoïdals) en un entorn 3D, on s’evita el contacte de cèl·lules directes - a les cèl·lules. La comunicació entre les cèl·lules es produeix mitjançant citocines solubles.

      Aplicacions:
      S'utilitza per estudiar la comunicació de contacte entre cèl·lules hepàtiques del cos.

      
      En resum, iPhase, com a líder en investigació biològica in vitro, proporciona solucions integrals per a proves de fàrmacs no - clínics. Des de l’aïllament i la cultura dels hepatòcits primaris des de diverses espècies fins al desenvolupament de productes de suport com ara Culture Media per a aplicacions específiques o plaques de col·lagen de multi -especificació - Som un soci de confiança per a clients de la indústria farmacèutica, compromès a proporcionar solucions de tall de tall per a investigacions no - clíniques.