Indukovaná frakce jater S9 potkana: metabolický aktivační systém pro testy genotoxicity a mutace in vitro

Klíčová slova: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, Mutační test, genotoxicita, genetická toxicita, indukovaná jaterní jater S9, test Ames, test mini Ames, chromozomální aberace, mikronukleus, HPRT/HGPRT test

Iphase produkt

Zavedení

Indukovaná jaterní krysa S9je klíčovou součástí při hodnoceníGenetická toxicitaPotenciál chemikálií, zejména v regulační toxikologii. Běžně se používá v kombinaci s testy in vitro, jako jeAmes test aMutační testy, pro vyhodnocení mutagenních vlastností sloučenin. Poskytováním enzymatického systému bohatého na cytochrom P450 (CYP450) hraje indukovaná frakce krysí jater S9 klíčovou roli při simulaci metabolických procesů, které se vyskytují v játrech, což pomáhá určit, zda chemikálie mohou potenciálně způsobit genetické mutace nebo rakovinu.

Indukovaná jaterní krysa S9

Frakce jater S9 označuje post - mitochondriální supernatant získaný z homogenátů jater potkana po řadě odstředěných kroků. Termín „indukovaný“ se týká léčby potkanů ​​specifickými sloučeninami, které zvyšují aktivitu jaterních enzymů, zejména enzymy cytochromu P450 (CYP450), které jsou zodpovědné za metabolismus širokého rozsahu xenobiotiky.

Indukovaná frakce játra S9 potkana obsahuje řadu enzymů, které jsou zapojeny do metabolismu chemikálií fáze I a fáze II. To zahrnuje enzymy, jako jsou cytochrom P450 monooxygenázy, které usnadňují oxidační biotransformaci substrátů, čímž napodobují metabolismus lidských jater.

Aktivita CYP450 a metabolická aktivace

Rodina enzymů cytochromu P450 (CYP450) hraje klíčovou roli v metabolismu široké škály látek, včetně mnoha léčiv, environmentálních chemikálií a karcinogenů. Indukovaná frakce játra S9 potkana obsahuje tyto enzymy a je nezbytná pro hodnocení chemikálií, které se mohou stát genotoxickým pouze po metabolické aktivaci.

Mnoho sloučenin je zpočátku toxické, ale po metabolismu v játrech se může stát toxickými. Tyto pro - mutageny (které vyžadují, aby se metabolická aktivace stala mutagenní) a pro - karcinogeny (které vyžadují aktivaci, aby způsobily rakovinu), lze detekovat pouze prostřednictvím testů, které zahrnují metabolický aktivační systém S9. Bez indukce metabolických enzymů, jako je CYP450, se tyto látky mohou zdát jako neškodné ve standardních testech genotoxicity.

Přidáním indukovaných jater jater S9 do testů in vitro mohou vědci posoudit, jak látka interaguje s enzymy CYP450. To je zvláště důležité pro léčiva, protože metabolismus enzymů CYP450 je kritickým krokem ve farmakokinetice mnoha léčiv.

Aplikace indukovaných jater potkanů ​​S9

1. 1. Test Ames (OECD 471)

Test Ames, nastíněný v pokynuOECD 471, je jednou z nejznámějších a široce používaných metod pro hodnocení mutagenity. Zahrnuje odhalení kmenů bakterií Salmonella testovací chemikálii, aby se zjistilo, zda indukuje mutace, které způsobují, že se bakterie vrátí do histidinu - nezávislého stavu.

Pro simulaci lidského metabolického procesu se do testovacího systému často přidává indukovaná jaterní jater S9. Frakce S9 poskytuje potřebné enzymy, včetně CYP450, které mohou být vyžadovány k metabolizaci sloučeniny na reaktivnější formu, která by mohla způsobit mutace v bakteriální DNA. Tato kombinace S9 s testem Ames umožňuje komplexnější hodnocení mutagenního potenciálu napodobováním přímých i metabolicky aktivovaných mutagenních mechanismů.

2. 2.Mutační testy (chromozomální aberační test, test Micronukleus a další testy in vitro)

Kromě testu Ames se mutační testy běžně používají k vyhodnocení genotoxického potenciálu chemických látek. Tyto testy jsou komplexnější při hodnocení řady genetických poškození, včetně chromozomálních mutací, genových mutací a tvorby mikronuklei. Indukovaná jaterní krysa S9 se používá v mutačních testech z následujících důvodů:

Microlukleus Test (OECD 487)

Tento test detekuje tvorbu mikronuklei v buňkách, což jsou malá extranukleární těla obsahující fragmenty chromozomů nebo celé chromozomy, které nebyly do jádra začleněny během buněčného dělení. The Microlukleus testmůže detekovat klastogenní (chromozom - lámání) a aneugenické (ovlivňující účinky na číslo chromozomu). K aktivaci testovací látky se zde používá indukovaná krysí jater S9, protože některé chemikálie způsobují chromozomální poškození pouze poté, co byly metabolizovány jaterními enzymy. Frakce S9 zvyšuje citlivost testu simulací metabolické aktivace, která se může vyskytnout in vivo.

Test chromozomální aberace (OECD 473)

Tento test vyhodnocuje, zda látka může způsobit strukturální poškození chromozomů vyvoláním zlomů, delecí, translokací nebo jiných typů aberací. Jako test Micronukleus,Test chromozomální aberaceLze použít s metabolickou aktivací nebo bez ní. Do testovacího systému se přidává indukovaná jaterní jater S9, aby napodobovala metabolické procesy v játrech, což umožňuje posouzení látek, které nemusí způsobit chromozomální poškození v jejich původní podobě, ale mohly by tak učinit po metabolismu jater.

Tabulka 1.. Srovnávací úvahy o mutačních testech

Test HPRT/HGPRT (OECD 476)

VTest HPRT/HGPRTKultury čínského křečka (CHO nebo V79) nebo lidských lymfoblastoidních (TK6) buněk jsou vystaveny testovací chemické látce v přítomnosti indukované metabolické směsi jater S9, která dodává enzymy CYP450 potřebné k přeměně pro -mutagenů na DNA -reaktivní druhy. Po krátkém ošetření a sedmidenním období exprese jsou buňky zpochybněny 6 -thioguaninem; Přežívají pouze klony nesoucí mutace ztráty -funkční mutace v genu hypoxanthin -ganitín -ganin -ganitín -ganin fosforibosyltransferázy. Porovnáním počtu mutantní kolonie s celkovou životaschopností určují vědci frekvenci mutace, která, pokud je reprodukovatelně zvýšena na souběžnou i historickou kontrolu, naznačuje genotoxický potenciál.

TK testy (OECD 490 & OECD 476)

TheTK test zaměstnává buď buňky L5178Y myší lymfomové buňky (OECD 490) nebo CHO (OECD 476) navrhovaný heterozygotní v lokusu thymidin kinázy. Po chemické expozici ± S9 směs, buňky se zotavují a jsou naneseny do média obsahujícího trifluorothymidin, který zabíjí TK -fiffiční buňky. Přežívající mutanty TK⁻ tvoří kolonie po dobu 10–14 dnů, přičemž mutanty s malými koly často odrážejí chromozomální příhody a mutanty s velkými koly odrážejícími bodové mutace. Stejně jako v testu HPRT/HGPRT, přísné kontroly cytotoxicity a pozitivní mutagenní benchmarky zajišťují, že pozorované zvýšení frekvence mutace spolehlivě odráží genotoxické riziko sloučeniny.

4. 4. Hodnocení rizika rakoviny

Indukovaná játra S9 potkana se také používá ve studiích zaměřených na hodnocení rakoviny, které způsobují potenciál látek. Simulací metabolických procesů, které se vyskytují v lidské játrech, může frakce S9 pomoci identifikovat sloučeniny, které by mohly vést k tvorbě reaktivních metabolitů schopných vazby na DNA a způsobit mutace, které by mohly vést k rakovině.

Vylepšený test Ames s indukovaným křečkem jater S9

Podle nejnovějších pokynů vydaných Evropskou léčivou agenturou (EMA) nemusí být tradiční test Ames natolik citlivý na to, aby detekoval mutagenní potenciál určitých nitrosaminových nečistot, zejména n - nitrosodimethylaminu (NDMA). Jako spolehlivější alternativu byl proto doporučen rozšířený test Ames, vyvinutý Národním centrem pro toxikologický výzkum (NCTR), divize americké správy potravin a léčiv (FDA). Zvýšený test Ames zavedl přidání indukovaného játra křečka S9, který prováděl v obsahu 30% játra S9 a 30% křečí játra S9. Desmosomální supernatanty potkana a křečka (S9S) by měly být připraveny z játracích hlodavců ošetřených enzymem cytochromu P450 - indukující látky. Použitím indukovaného křečka jater S9 tento zvýšený test lépe simuluje metabolismus lidského člověka a zvyšuje spolehlivost výsledků.

Závěr

Indukovaná krysí játra S9 slouží jako kritický nástroj při testování genotoxicity, pomáhá vědcům a regulačním agenturám hodnotit mutagenní a karcinogenní potenciál chemikálií. Poskytováním metabolického aktivačního systému zvyšuje schopnost testů, jako je test Ames, testy mutací a studie aktivity CYP450, detekovat látky, které vyžadují, aby se metabolická aktivace stala genotoxickou. Jeho aplikace jsou nezbytné pro zajištění bezpečnosti nových léků, chemikálií a spotřebních výrobků. Díky své úloze při simulaci metabolismu lidských jater je indukovaná frakce krysí jater S9 nadále nepostradatelnou součástí moderní toxikologie a hodnocení regulační bezpečnosti.