Primární hepatocyty: klíčový nástroj pro pokrok v klinickém výzkumu léčiva in vitro

Primární hepatocyty: klíčový nástroj pro pokrok v klinickém výzkumu léčiva in vitro

Játra jako primární orgán pro expozici léčiva hrají klíčovou roli v procesech metabolismu léčiva a toxicity. Primární hepatocyty mají plné spektrum buněčných charakteristik a fyziologických hladin enzymů a kofaktorů, včetně membrány - vázané enzymy, jako je cytochrom P450 (smíšená - funkční oxidáza v hladkém endoplazmatickém retikulu) a cytosolické esterázy, a encopují všechny metabolické dráhy v játrech. Z tohoto důvodu jsou primární hepatocyty široce považovány za zlatý standard pro konstrukci in vitro jaterních modelů a jsou upřednostňováni vědci v interakci léčiva, metabolismu léčiva a studií toxicity. Tento článek poskytuje přehled modelů 2D a 3D kultury založené na primárních hepatocytech a jejich aplikacích při vývoji léčiv.

Klíčová slova: Primární hepatocyty, 2D kultivace, 3D kultivace, organoidy, co - kultura.

1. 1. izolace primárních hepatocytů

Izolace primárních hepatocytů je kritickým krokem k vytvoření in vitro jaterních modelů, přičemž nejčastěji se používají metoda perfuzní perfuze dvou kroků. U menších zvířat může být perfuze jater prováděna pomocí portální žíly nebo dolního vena cava, zatímco větší zvířata obvykle vyžadují perfuzi prostřednictvím jaterních laloků nebo segmentů. Úspěšnou izolaci hepatocytů ovlivňuje několik klíčových faktorů: za prvé, kolagenáza by měla být ne - cytotoxická. Za druhé, načasování trávení je zásadní -Při trávení i nad - trávení může ohrozit výtěžek a životaschopnost hepatocytů. Zatřetí, stav jater musí být optimální, protože hepatocyty jsou vysoce citlivé na ischemické poškození. Játra použitá pro přípravu hepatocytů by měly být rychle ochlazeny, aby se snížila rychlost metabolismu a zabránila metabolické hypoxii a následné ischémii.

Standardy pro primární hepatocyty používané při výzkumu léčiv jsou následující:

1. 2. Primární kultura hepatocytů 2D

Model suspenze hepatocytů

Obsahuje kompletní léčivo - metabolizující enzymy a kofaktory, takže je vhodný pro studium různých cest metabolické clearance. Životaschopnost suspenzních hepatocytů a aktivita enzymů metabolizujících léčivo se však s rostoucím dobou inkubace postupně snižují, což však omezuje dobu inkubace na maximálně 4 hodiny. Tento model se obvykle používá k odhadu clearance léčiv se středně vysokou až vysokou mírou clearance. Pokud je míra clearance menší než 20%, nelze určit přesné hodnoty clearance. Tradiční suspenzní hepatocyty - Modely metabolismu založené na in vitro jsou nedostatečné pro generování detekovatelných metabolických reakcí pro pomalé metabolizující sloučeniny, čímž omezují jejich schopnost předpovídat míru clearance a metabolické produkty těchto sloučenin. Metoda relé suspenze hepatocytů (obrázek 1) lze použít k prodloužení doby inkubace na 20 hodin nebo dokonce delší.

Aplikace:Enzymatická aktivita a studie metabolické stability pro léčiva s malými molekulami.

Obrázek 1.. Proces přenosu metody relé suspenze hepatocytů

Zdroj: Drug Metab Dispus, 2012,40 (9): 1860–1865

Model hepatocytů s celoročními

Primární hepatocyty jsou kultivovány ve 2D systému na kolagenovém kultivačním destičkách. Hepatocyty vykazují epiteliální morfologii s vyčnívajícími jádry, často prezentujícími se v binukleační formě. Nevýhody kultury monovrstvy jediné hepatocyty zahrnují: 1. změna buněčné polarity a funkce.2. Nedostatek jiných relevantních typů buněk (tj. Ne - parenchymální buňky), které jsou vyžadovány pro normální funkci.3. Neschopnost poskytovat dostatečné živiny a parakrinní faktory k podpoře hepatocytů při provádění jejich funkcí (jako je biosyntéza proteinu žlučové a sérové ​​proteiny).

Aplikace:

1). Hodnocení léčiva - Interakce léčiva:To zahrnuje indukci enzymu, inhibici enzymu a studie transportéru. Zaprvé, když léčivo působí jako induktor, může to vést ke zvýšené expresi enzymů a transportérů metabolizujících léčivo. Silné induktory mohou upregulovat více genů současně, jako je fenobarbitální indukce CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT a několik transportních proteinů, jako je MRP2. Za druhé, existují druhy specifické rozdíly v tom, jak hepatocyty reagují na induktory. Například rifampicin je účinným induktorem pro lidské a králičí hepatocyty, ale nemá žádný indukční účinek na hepatocyty potkana. Nakonec může suboptimální hustota pokovování hepatocytů vést ke snížení bazální exprese P450 a uměle se zvýšené indukční reakce. Jak je znázorněno na obrázku 3, hepatocyty při nižší hustotě pokovování vykazují nižší bazální aktivitu CYP1A2, CYP2B6 a CYP3A4, ale silnější indukční reakce. K získání fyziologicky relevantních údajů jsou proto nezbytné zdravé hepatocyty při vhodné hustotě pokovování.

Obrázek 2. Vztah mezi hustotou pokovování kryokonzervovaných lidských hepatocytů a indukcí enzymů

Zdroj: Aktuální technologie objevování drog, 2010, 7: 188 - 198

2). Hodnocení hepatotoxicity: Pozorování morfologických změn pod světelným mikroskopem, jako je morfologie buněk, agregace vakuoly a lipidů a připojení/oddělení buněk. Detekce nekrózy hepatocytů (jak ukazuje aspartát aminotransferáza, laktát dehydrogenáza a alanin aminotransferáza) a apoptózy (fragmentace DNA). Pro cytokin - cytotoxicita zprostředkovaná jednotlivá monovrstva nemůže předpovídat toxické reakce v důsledku regulace látkami uvolňovanými ze sousedních neparencmatických buněk, jako jsou Kupfferovy buňky, stelalátové buňky a sinusoidní endoteliální buňky.

3). „Reléová metoda“ pro studium pomalé metabolizační clearance a jejích metabolitů: Aktivita léčiva - metabolizující enzymy v hepatocytech s nádobou se začíná snižovat po 24 hodinách pokovování. Po inkubaci převáděcích hepatocytů se sérem - volným médiem obsahujícím zájmovou sloučeninu po dobu 24 hodin se médium shromažďuje a smíchá a poté přeneseno do nových přeplněných hepatocytů pro další studium (obrázek 3).

Obrázek 3. Proces přenosu metody relé s převodovkou hepatocytů

Zdroj: Dopisy metabolismu léčiva, 2016, 10: 3 - 15

3). Vyhodnoťte buněčnou absorpci, endocytózu, endozomální únik a umlčování na cílový gen hepatocytů - cílené malá nukleová kyselina léčiva.

Model kultivace sendviče

In vitro mohou být hepatocyty kultivovány mezi dvěma vrstvami kolagenu nebo matrigelu pro rekonstrukci struktur ve vivo, známé jako sendvičová kultivace. Hepatocyty kultivované mezi dvěma vrstvami gelu - kolagenu (sendvičová struktura) mohou zlepšit morfologii a životaschopnost buněk a udržovat jejich funkčnost po delší dobu. Kromě toho mohou hepatocyty v sendvičové kultuře obnovit polaritu, což umožňuje správnou lokalizaci bazolaterálních a kanalikulárních transportérů, jakož i tvorbu funkčních sítí žlučových kanálů (obrázek 4).

Obrázek 4. polarizovaná exprese transportérů v sendvičovém modelu lidského hepatocytů

Zdroj: Aktuální technologie objevování drog, 2010, 7, 188 - 198

Aplikace:

1. 1). Odhadování biliárního vylučování sloučenin.
2. 2). Vyhodnocení jaterní a biliární distribuce endogenních a exogenních sloučenin a metabolitů.
3. 3). Odhadování clearance zprostředkované metabolismem a transportéry a konstrukce fyziologických farmakokinetických modelů.
4. 4). Studium hepatotoxicity a poskytování mechanismů pro klinické léčivo - indukované poškození jater. Data jsou integrována do systémových farmakologických modelů k predikci potenciálního poškození jater u lidí.
5.  
   1. 3. primární hepatocyty 3D kultura

6. Ve 3D kultivačních systémech jsou hepatocyty kultivovány ve třetí rozměrové matici, která lépe napodobuje in vivo jaterní architekturu ve srovnání s 2D monovrstvými kulturami. Tyto systémy podporují interakce matice buněk a buněk a buněk, které mohou obnovit více fyziologických funkcí jater, včetně metabolismu léčiva, sekrece proteinů a tvorby žluči. Primární hepatocytové 3D kultury lze použít ke studiu játra specifických funkcí ve více in vivo - jako prostředí, které nabízejí výhody pro testování léčiv, hodnocení toxicity a modelování nemocí.

   Spheroid Model

Prostřednictvím technik, jako je kultura ultra - nízkého připojení, kultura visící kapky a kultura magnetických buněk (obrázek 5), mohou primární hepatocyty agregovat do sféroidních agregátů s průměrem až 150 - 175 um, aniž by se spoléhaly na vnější matrice. Jednou z výhod kultury sféroidů je, že každý sféroid vyžaduje pouze 1 330 - 2 000 buněk, což významně snižuje počet buněk ve srovnání s jinými 3D kultivačními technikami. Nedávné studie ukázaly, že primární kultury sféroidů hepatocytů mohou udržovat až 5 týdnů, přičemž aktivita enzymu CYP zůstává téměř nezměněna mezi 8. a 35. dnem. Proteomická analýza odhalila, že ve srovnání s sendvičovou kulturou jsou enzymy odpovědné za absorpci léčiva, distribuci, metabolismus a vylučování po dobu 14 dnů v sferoidové kultuře. Játra jsou však mnohem složitější než agregát buněk. Basolaterální strana hepatocytů interaguje s krví, zatímco žluč vytéká z apikální strany, což je klíčovým rysem komplexní struktury jaterních lobulů, a to dosud nelze replikovat v sféroidním modelu.

Aplikace:

1. 1). Studie pomalé metabolizační clearance a jeho metabolitů.
2. 2). Výzkum hepatotoxicity.
3. 3). Hodnocení buněčné absorpce, endocytózy, endozomálního úniku a umlčování účinku na cílové geny hepatocytů - cílené malá nukleová kyselina léčiva.

Obrázek 5. Metoda sféroidní kultury

Model jaterních organoidů

Definice konsensu organoidů je: 3D struktury odvozené z kmenových buněk, progenitorových buněk nebo diferencovaných buněk, schopné reprodukovat určité funkce a struktury nativní tkáně in vitro, účinně napodobující in vivo mikroprostředí a buňky - buněčné interakce. Organoidy jater byly identifikovány jako nejpokročilejší model pro výzkum biologie lidských jater.

Zdroje buněk pro konstrukci jaterních organoidů:

① Pluripotentní kmenové buňky (PSC):

Embryonální kmenové buňky (ESC) a indukované pluripotentní kmenové buňky (IPSC) mají vysokou pluripotenci, plasticitu a neomezenou proliferativní kapacitu. Pod vlivem specifických signálních faktorů se diferencují na hepatocyty jako buňky s aktivitou a funkcí. Organoidy jater odvozené z PSC však mohou podléhat epigenetickým a genetickým změnám a během amplifikace vykazují změny chromozomální aneuploidie.

Aplikace:

1. 1). Modely genetického onemocnění jater
2. 2). Infekční modely onemocnění jater
3. 3). Testování cytotoxicity léčiva

② Tkáň jater - odvozené buňky: Mezi ně patří cholangiocyty a hepatocyty. Zralé hepatocyty si zachovávají potenciál kmenových buněk a proliferativní schopnost ve specifickém prostředí. Ve srovnání s organoidy odvozenými od PSC jsou organoidy odvozené z primární tkáně zralejší, se stabilnějšími genomy a udržují fenotypovou a genetickou stabilitu během dlouhodobého termínu in vitro kultury. Avšak dlouhodobá proliferativní kapacita zralých lidských hepatocytových organoidů je ve srovnání s fetálními lidskými hepatocyty nebo primární hepatocyty dospělých myší. Kultivace organoidů dospělých hepatocytů zůstává náročné.

Kultivační metoda (obrázek 6): Tkáň jater je štěpena do jednotlivých buněk a směs matrigelu a buněk je naočkována do destičky 24 - studny za účelem vytvoření kupole - tvarovaných struktur. Inkubujte v inkubátoru buněčné kultury (37 ° C) po dobu 15 minut. Po zvážení přidejte konkrétní kultivační médium. Průchod po přibližně 14 dnech. Po 7 - 10 dnech nahraďte původní médium diferenciačním médiem.

Aplikace:

1. 1). Hepatotoxicity modely
2. 2). Studie poruch metabolismu in vitro
3. 3). Non - Alkoholické mastné onemocnění jater
4. 4). Vývoj léčiva pro benigní a maligní onemocnění jater

Obrázek 6. Proces kultivace a průchodu tkání - odvozené jaterní organoidy

Zdroj: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

Srovnání kultury sféroidů a organoidních kultur

4. Primární hepatocyty Co - Kultura model

1. 1. 2D primární hepatocyty Co - Kultura model
      

      Ve 2D primárním modelu hepatocytů Co - kulturní model jsou dva nebo více různých typů buněk smíchány a kultivovány ve dvou dimenzionálním prostředí. Klíčovým rysem tohoto modelu je přímá interakce mezi různými typy buněk, interakce mezi buňkami a extracelulární matricí nebo nepřímým přenosem signálu cytokiny a chemickou komunikací. Primární funkce hepatocytů, jako je produkce albuminu a schopnost metabolismu léčiva, lze udržovat po dobu až tří týdnů.

      Aplikace:

      1. 1). Primární hepatocyty Co - kultivované fibroblasty: Tento model se používá ke studiu rychlosti clearance pomalých - metabolizujících sloučenin a jejich metabolitů.
      2. 2). Primární hepatocyty CO - kultivované ne - parenchymálními jaterními buňkami (např. Stellate buňkami, sinusoidní endoteliální buňky): tento model je užitečný pro výzkum léčiva - indukované poškození jater (DILI), protože pomáhá zkoumat roli cytokinů, chemokiny a růstové faktory v modulaci jater adaptivních odpovědí po expozici léčiva.
      3. 3). Primární hepatocyty CO - kultivované T buňkami: Tento model se používá k detekci metabolismu jaterních léčiv - specifické odpovědi T buněk.
      4. 4). IPhase's Hepatomax ™Co - Kulturní systém: iPhase vyvinul systém kultury s primárními hepatocyty z různých druhů, známý jako hepatomax™. Podkorem lidských primárních hepatocytů se stromálními buňkami je možné udržovat dobrý lék - Metabolizující enzymatickou aktivitu v lidských hepatocytech po dobu až 3 týdnů. Tento systém je vhodný pro studium pomalého - metabolizačního míry sloučeniny a jejich metabolity.

      Tento model Co - Culture poskytuje fyziologicky relevantní platformu pro hodnocení metabolismu léčiva, toxicity a procesů souvisejících s játry a nabízí vhled do toho, jak různé typy buněk přispívají k funkci jater a onemocnění.
      
      

      3D primární hepatocyty Co - Kultura model

      Přímá 3d Co - Kultura: Tento model zahrnuje smíchání dvou nebo více různých typů jaterních buněk (např. Primární hepatocyty, sinusoidní endoteliální buňky, jaterní hvězdicové buňky, Kupfferovy buňky) za vzniku samostatně sestavených sféroidů nebo jejich kultivace ve 3D prostředí konstruovaném s materiály, jako je kolagen, fibrin, alginát nebo hydrogely. Přímá 3D CO - kultura umožňuje blízkou interakci mezi různými jaterními buňkami prostřednictvím mechanismů, jako je buněčná adheze - buněk, parakrinní signalizace prostřednictvím rozpustných cytokinů a extracelulární matricové adhezi, což umožňuje komunikaci mezi hepatocyty.

      Aplikace:

      1. 1). Model fibrózy jater: Používá se ke studiu mechanismů a progrese jaterní fibrózy.
      2. 2). Model poškození jater (DILI) indukovaným indukovaným jaterním poškozením: pomáhá simulovat a hodnotit poškození jater způsobené léky.
      3. 3). Interakce léčiva, metabolismus léčiva a indukce enzymu: hodnotí, jak různé léky interagují, jak jsou metabolizovány a jak indukují jaterní enzymy.

      Nepřítomná 3D Co - Kultura: Tato metoda používá fyzický separační systém (např. Transwell nebo jiné materiály) ke kultuře dva nebo více typů buněk (jako jsou primární hepatocyty s buňkami NIH/3T3 nebo sinusoidální endoteliální buňky) v 3D prostředí, kde je zabráněno přímé buňce na - buněčný kontakt. Komunikace mezi buňkami dochází prostřednictvím rozpustných cytokinů.

      Aplikace:
      Používá se pro studium net - kontaktní komunikace mezi jaterními buňkami v těle.

      
      Stručně řečeno, iPhase, jako vůdce biologického výzkumu in vitro, poskytuje komplexní řešení pro testování klinických léčiv. Od izolace a kultury primárních hepatocytů z různých druhů k vývoji podpůrných produktů, jako jsou kultivační média pro specifické aplikace nebo multi - Specifikace kolagen - Potažené destičky, je iPhase věnována nabídnutí nejlepších in vitro výzkumných nástrojů pro objevování a vývoj léčiv. Jsme důvěryhodným partnerem pro klienty ve farmaceutickém průmyslu, který se zavázal poskytovat řezné řešení pro klinický výzkum.