Induceret rottelever S9 -fraktion: Et metabolisk aktiveringssystem til in vitro -genotoksicitet og mutationstest

Nøgleord: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, mutationstest, genotoksicitet, genetisk toksicitet, induceret rottelever S9, ames test, mini ames test, kromosomal afvigelse, mikronukleus, HPRT/HGPRT assay, TK Assay

IPhase -produkt

Indledning

Induceret rottelever S9er en nøglekomponent i vurderingen afgenetisk toksicitetPotentialet ved kemikalier, især inden for regulatorisk toksikologi. Det bruges ofte i kombination med in vitro -assays, såsomAmes test ogMutationstest, for at evaluere de mutagene egenskaber ved forbindelser. Ved at tilvejebringe enzymatisk system rig på cytochrome P450 (CYP450), spiller den inducerede rottelever S9 -fraktion en afgørende rolle i simuleringen af ​​de metaboliske processer, der forekommer i leveren, hvilket hjælper med at bestemme, om kemikalier potentielt kan forårsage genetiske mutationer eller kræft.

Induceret rottelever S9

Lever S9 -fraktionen henviser til et indlæg - mitokondrial supernatant opnået fra rotteleverhomogenater efter en række centrifugeringstrin. Udtrykket "induceret" henviser til behandlingen af ​​rotter med specifikke forbindelser, der forbedrer aktiviteten af ​​leverenzymer, især cytochrome P450 -enzymerne (CYP450), som er ansvarlige for metabolismen af ​​en lang række xenobiotikum.

Den inducerede rottelever S9 -fraktion indeholder en række enzymer, der er involveret i fase I og fase II -metabolismen af ​​kemikalier. Dette inkluderer enzymer, såsom cytochrome P450 monooxygenaser, som letter oxidativ biotransformation af substrater og derved efterligner human levermetabolisme.

CYP450 Aktivitet og metabolisk aktivering

Cytochrome P450 enzymfamilien (CYP450) spiller en central rolle i metabolismen af ​​en lang række stoffer, herunder mange farmaceutiske stoffer, miljømæssige kemikalier og kræftfremkaldende stoffer. Den inducerede rottelever S9 -fraktion indeholder disse enzymer og er vigtig for evaluering af kemikalier, der muligvis kun bliver genotoksiske efter metabolisk aktivering.

Mange forbindelser er oprindeligt ikke - giftige, men kan blive giftige efter stofskifte i leveren. Disse pro - mutagener (som kræver metabolisk aktivering for at blive mutagen) og pro - carcinogener (som kræver aktivering for at forårsage kræft) kan kun påvises gennem assays, der inkluderer et S9 -metabolisk aktiveringssystem. Uden induktion af metaboliske enzymer som CYP450 kan disse stoffer synes at være ufarlige i standardgenotoksicitetstest.

Ved at tilsætte induceret rottelever S9 til in vitro -assays kan forskere vurdere, hvordan et stof interagerer med CYP450 -enzymerne. Dette er især vigtigt for farmaceutiske stoffer, da metabolisme af CYP450 -enzymer er et kritisk trin i farmakokinetikken for mange lægemidler.

Anvendelser af induceret rottelever S9

1. 1. Ames Test (OECD 471)

Ames -testen, der er beskrevet i retningslinjeOECD 471, er en af ​​de mest velkendte og vidt anvendte metoder til vurdering af mutagenicitet. Det involverer at udsætte stammer af Salmonella -bakterier for et testkemikalie for at se, om det inducerer mutationer, der får bakterierne til at vende tilbage til en histidin - uafhængig tilstand.

For at simulere den humane metaboliske proces føjes induceret rotte -lever S9 ofte til testsystemet. S9 -fraktionen tilvejebringer de nødvendige enzymer, inklusive CYP450, som kan være påkrævet for at metabolisere forbindelsen til en mere reaktiv form, der kan forårsage mutationer i bakterie -DNA. Denne kombination af S9 med AMES -testen muliggør en mere omfattende vurdering af mutagen potentiale ved at efterligne både direkte og metabolisk aktiverede mutagene mekanismer.

2. 2.Mutationstest (kromosomal afvigelsestest, mikronukleus -test og andre in vitro -assays)

Foruden AMES -testen bruges ofte mutationstests til at evaluere kemikaliets genotoksiske potentiale. Disse tests er mere omfattende til vurdering af en række genetiske skader, herunder kromosomale mutationer, genmutationer og dannelsen af ​​mikronuklei. Induceret rottelever S9 bruges i mutationstest af følgende grunde:

Micronucleus test (OECD 487)

Denne test detekterer dannelsen af ​​mikronuklei i celler, som er små, ekstranukleære legemer, der indeholder fragmenter af kromosomer eller hele kromosomer, der ikke er inkorporeret i kernen under celledeling. De Micronucleus -testkan detektere clastogenisk (kromosom - brud) og aneugenisk (påvirker kromosomnummer) effekter. Induceret rottelever S9 bruges her til at aktivere teststoffet metabolisk, da nogle kemikalier kun forårsager kromosomal skade, når de er blevet metaboliseret af leverenzymer. S9 -fraktionen forbedrer testens følsomhed ved at simulere den metaboliske aktivering, der kan forekomme in vivo.

Kromosomal afvigelsestest (OECD 473)

Denne test evaluerer, om et stof kan forårsage strukturelle skader på kromosomer ved at inducere pauser, sletninger, translokationer eller andre typer afvigelser. Som mikronukleus -testen,Kromosomal aberrationstestkan påføres med eller uden metabolisk aktivering. Induceret rottelever S9 tilsættes til testsystemet for at efterligne de metaboliske processer i leveren, hvilket tillader vurdering af stoffer, der muligvis ikke forårsager kromosomal skade i deres oprindelige form, men kunne gøre det efter levermetabolisme.

Tabel 1. Sammenlignende overvejelser om mutationstest

HPRT/HGPRT Assay (OECD 476)

IHPRT/HGPRT -assay, Kulturer af kinesisk hamster (CHO eller V79) eller human lymfoblastoid (TK6) celler udsættes for testkemikaliet i nærvær af en induceret rotte -lever S9 -metabolisk blanding, der leverer CYP450 -enzymer, der kræves for at omdanne pro -mutagens til DNA -reaktive arter. Efter en kort behandling og en syv -dages ekspressionsperiode udfordres celler med 6 -thioguanin; Kun kloner, der bærer tab af funktionsmutationer i hypoxanthine -guanin -phosphoribosyltransferase -genet, overlever. Ved at sammenligne mutant kolonitællinger med den samlede levedygtighed bestemmer forskere en mutationsfrekvens, der, hvis det er reproducerbart forhøjet over både samtidige og historiske kontroller, indikerer genotoksisk potentiale.

TK -assays (OECD 490 & OECD 476)

DeTK -assay Anvender enten L5178Y muselymfomceller (OECD 490) eller CHO -celler (OECD 476) konstrueret heterozygot ved thymidinkinase locus. Efter kemisk eksponering ± S9 -blanding gendannes cellerne og er udpladet i medium indeholdende trifluorothymidin, der dræber TK -proficale celler. Overlevende Tk⁻ -mutanter danner kolonier over 10-14 dage, hvor småkoloniske mutanter ofte reflekterer kromosomale begivenheder og store farvemutanter, der reflekterer punktmutationer. Som i HPRT/HGPRT -assayet sikrer streng cytotoksicitetskontrol og positive mutagen -benchmarks, at observerede stigninger i mutationsfrekvens pålideligt afspejler en forbindelse's genotoksiske risiko.

4. 4. Kræftrisikovurdering

Induceret rottelever S9 bruges også i undersøgelser, der sigter mod at vurdere kræft - forårsager stoffer. Ved at simulere de metaboliske processer, der forekommer i den humane lever, kan S9 -fraktionen hjælpe med at identificere forbindelser, der kan føre til dannelse af reaktive metabolitter, der er i stand til at binde til DNA og forårsage mutationer, der kan føre til kræft.

Forbedret Ames -test med induceret hamsterelever S9

I henhold til de seneste retningslinjer, der er udstedt af det europæiske medicinalagentur (EMA), er den traditionelle AMES -test muligvis ikke følsom nok til at detektere det mutagene potentiale for visse N - nitrosamin -urenheder, især N - nitrosodimethylamin (NDMA), blandt andre. Derfor er den forbedrede Ames -test, udviklet af National Center for Toxicological Research (NCTR), en afdeling af U.S. Food and Drug Administration (FDA), blevet anbefalet som et mere pålideligt alternativ. Den forbedrede AMES -test introducerede tilføjelse af induceret hamsterlever S9, som blev udført i indeholdende 30% rottelever S9 og 30% hamster lever S9. Rotte- og hamster desmosomale supernatanter (S9S) skal fremstilles fra gnaverlever behandlet med cytochrome P450 -enzym - inducerende stoffer. Ved at bruge induceret hamsterelever S9 simulerer denne forbedrede test bedre menneskelig metabolisme og øger pålideligheden af ​​resultaterne.

Konklusion

Induceret rottelever S9 tjener som et kritisk værktøj i genotoksicitetstest, hvilket hjælper forskere og regulerende agenturer med at vurdere det mutagene og kræftfremkaldende potentiale for kemikalier. Ved at tilvejebringe et metabolisk aktiveringssystem forbedrer det evnen til assays som Ames -test, mutationstest og CYP450 -aktivitetsundersøgelser for at detektere stoffer, der kræver metabolisk aktivering for at blive genotoksiske. Dets applikationer er vigtige for at sikre sikkerheden ved nye lægemidler, kemikalier og forbrugerprodukter. Med sin rolle i simuleringen af ​​human levermetabolisme er den inducerede rottelever S9 -fraktion fortsat en uundværlig del af moderne toksikologi og lovgivningsmæssige sikkerhedsvurderinger.