Induzierte Rattenleber -S9 -Fraktion: Ein metabolisches Aktivierungssystem für In -vitro -Genotoxizitäts- und Mutationstests

Schlüsselwörter: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, Mutation Test, Genotoxicity, Genetic Toxicity, Induced Rat Liver S9, Ames Test, Mini Ames Test, Chromosomal Aberration, Micronucleus, HPRT/HGPRT Assay, TK Assay

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Einführung

Induzierte Rattenleber S9ist eine Schlüsselkomponente bei der Beurteilung derGenetische ToxizitätPotential von Chemikalien, insbesondere in der Regulierungstoxikologie. Es wird üblicherweise in Kombination mit In -vitro -Tests verwendet, wie sieAmes -Test UndMutationstests, um die mutagenen Eigenschaften von Verbindungen zu bewerten. Durch die Bereitstellung eines enzymatischen Systems, das reich an Cytochrom P450 (CYP450) ist, spielt die induzierte Rattenleber -S9 -Fraktion eine entscheidende Rolle bei der Simulation der in der Leber auftretenden Stoffwechselprozesse, und dabei zu bestimmen, ob Chemikalien potenziell genetische Mutationen oder Krebs verursachen können.

Induzierte Rattenleber S9

Die Leber -S9 -Fraktion bezieht sich auf einen post - mitochondrialen Überstand, der nach einer Reihe von Zentrifugationsschritten aus Rattenleberhomogenaten erhalten wurde. Der Begriff "induziert" bezieht sich auf die Behandlung von Ratten mit spezifischen Verbindungen, die die Aktivität von Leberenzymen verbessern, insbesondere der Cytochrom -P450 -Enzyme (CYP450), die für den Stoffwechsel eines weiten Bereichs von Xenobiotikum verantwortlich sind.

Die induzierte Rattenleber -S9 -Fraktion enthält eine Vielzahl von Enzymen, die am Phase -I- und Phase -II -Metabolismus von Chemikalien beteiligt sind. Dies umfasst Enzyme wie Cytochrom -P450 -Monooxygenasen, die die oxidative Biotransformation von Substraten erleichtern und damit den menschlichen Leberstoffwechsel nachahmen.

CYP450 -Aktivität und metabolische Aktivierung

Die Cytochrom -P450 -Enzymfamilie (CYP450) spielt eine zentrale Rolle beim Stoffwechsel einer Vielzahl von Substanzen, darunter viele Pharmazeutika, Umweltchemikalien und Karzinogene. Die induzierte Rattenleber -S9 -Fraktion enthält diese Enzyme und ist für die Bewertung von Chemikalien, die nach metabolischer Aktivierung nur genotoxisch werden, wesentlich.

Viele Verbindungen sind anfangs nicht toxisch, können aber nach dem Stoffwechsel in der Leber toxisch werden. Diese Pro -- -Mutagene (für die mutagene mutagene Aktivierung erforderlich ist) und pro - Karzinogene (für die Aktivierung erforderlich ist, um Krebs zu verursachen) können nur durch Assays nachgewiesen werden, die ein S9 -Stoffwechselaktivierungssystem enthalten. Ohne die Induktion von metabolischen Enzymen wie CYP450 scheinen diese Substanzen bei Standard -Genotoxizitätstests harmlos zu sein.

Durch die Zugabe induzierter Rattenleber S9 zu In -vitro -Tests können Forscher bewerten, wie eine Substanz mit den CYP450 -Enzymen interagiert. Dies ist besonders wichtig für Arzneimittel, da der Stoffwechsel durch CYP450 -Enzyme ein kritischer Schritt in der Pharmakokinetik vieler Arzneimittel ist.

Anwendungen der induzierten Rattenleber S9

1. 1. Ames -Test (OECD 471)

Der in Richtlinie beschriebene Ames -TestOECD 471ist eine der bekanntesten und am häufigsten verwendeten Methoden zur Beurteilung der Mutagenität. Es umfasst eine Testchemikalie, um zu sehen, ob es Mutationen induziert, die dazu führen, dass die Bakterien in einen Histidin - unabhängigen Zustand zurückkehren.

Um den menschlichen Stoffwechselprozess zu simulieren, wird das Testsystem häufig induzierte Rattenleber S9 hinzugefügt. Die S9 -Fraktion liefert die erforderlichen Enzyme, einschließlich CYP450, die erforderlich sein kann, um die Verbindung in eine reaktivere Form zu metabolisieren, die Mutationen in der bakteriellen DNA verursachen kann. Diese Kombination von S9 mit dem AMES -Test ermöglicht eine umfassendere Bewertung des mutagenen Potentials, indem sie sowohl direkte als auch metabolisch aktivierte mutagene Mechanismen nachahmt.

2. 2.Mutationstests (chromosomaler Aberrationstest, Mikronukleus -Test und andere In -vitro -Tests)

Zusätzlich zum AMES -Test werden Mutationstests üblicherweise verwendet, um das genotoxische Potential von Chemikalien zu bewerten. Diese Tests sind umfassender bei der Bewertung einer Reihe genetischer Schäden, einschließlich chromosomaler Mutationen, Genmutationen und der Bildung von Mikronuklei. Die induzierte Rattenleber S9 wird aus folgenden Gründen in Mutationstests verwendet:

Mikronukleus -Test (OECD 487)

Dieser Test erkennt die Bildung von Mikronuklei in Zellen, bei denen es sich um kleine, extranukleäre Körper handelt, die Fragmente von Chromosomen oder ganze Chromosomen enthalten, die während der Zellteilung nicht in den Kern eingebaut wurden. Der Mikronukleus -TestKann klastogene (Chromosom - Brechen) und angenische (beeinflussen Chromosomenzahl) nachweisen. Die induzierte Rattenleber S9 wird hier verwendet, um die Testsubstanz metabolisch zu aktivieren, da einige Chemikalien nur chromosomale Schäden verursachen, wenn sie durch Leberenzyme metabolisiert wurden. Die S9 -Fraktion verbessert die Empfindlichkeit des Tests, indem die metabolische Aktivierung simuliert, die in vivo auftreten kann.

Chromosomenaberrationstest (OECD 473)

In diesem Test wird bewertet, ob ein Substanz durch Induzieren von Pausen, Deletionen, Translokationen oder anderen Arten von Aberrationen strukturelle Schäden an Chromosomen verursachen kann. Wie der Mikronukleus -Test dieChromosomalaberrationstestkann mit oder ohne metabolische Aktivierung angewendet werden. Die induzierte Rattenleber S9 wird dem Testsystem hinzugefügt, um die Stoffwechselprozesse in der Leber nachzuahmen und die Bewertung von Substanzen zu ermöglichen, die in ihrer ursprünglichen Form möglicherweise keine chromosomalen Schäden verursachen, dies jedoch nach dem Leberstoffwechsel tun könnten.

Tabelle 1. Vergleichende Überlegungen von Mutationstests

HPRT/HGPRT Assay (OECD 476)

ImHPRT/HGPRT Assay, Kulturen des chinesischen Hamsters (CHO oder V79) oder des menschlichen Lymphoblastoidzellen (TK6) werden der Testchemikalie in Gegenwart einer induzierten Rattenleber -S9 -Stoffwechselmischung ausgesetzt, die CYP450 -Enzyme liefert, die zur Umwandlung von Pro -Mutagenen in DNA -Reaktive erforderlich sind. Nach einer kurzen Behandlung und einer siebentägigen Expressionsperiode werden die Zellen mit 6 -Thioguanin in Frage gestellt. Nur Klone mit Verlust -Of -Funktionsmutationen im Hypoxanthin -Guanin -Phosphoribosyltransferase -Gen überleben. Durch den Vergleich der Mutantenkoloniezahlen mit der Gesamtlebensfähigkeit bestimmen die Forscher eine Mutationsfrequenz, die, wenn sie sowohl über gleichzeitige als auch historische Kontrollen reproduzierbar erhöht wird, auf das genotoxische Potential hinweist.

TK -Assays (OECD 490 & OECD 476)

DerTK -Assay verwendet entweder L5178Y -Maus -Lymphomzellen (OECD 490) oder CHO -Zellen (ZellenOECD 476) Heterozygot am Thymidinkinase -Locus. Nach der chemischen Exposition ± S9 -Mischung erholen sich die Zellen und werden in Medium, das Trifluorothymidin enthält, plattiert, das TK -profizierte Zellen abtötet. Überlebende TK⁻ -Mutanten bilden Kolonien über 10 bis 14 Tage, wobei Kleinkolony -Mutanten häufig chromosomale Ereignisse und Großkolony -Mutanten widerspiegeln, die Punktmutationen widerspiegeln. Wie im HPRT/HGPRT -Assay stellen strenge Zytotoxizitätskontrollen und positive Mutagen -Benchmarks sicher, dass beobachtete Zunahme der Mutationsfrequenz das genotoxische Risiko einer Verbindung zuverlässig widerspiegeln.

4. 4.. Krebsrisikobewertung

Die induzierte Rattenleber S9 wird auch in Studien verwendet, die die Beurteilung des Krebs - das Potenzial von Substanzen verursachen. Durch die Simulation der Stoffwechselprozesse, die in der menschlichen Leber auftreten, kann die S9 -Fraktion Verbindungen identifizieren, die zur Bildung von reaktiven Metaboliten führen können, die an DNA binden und Mutationen verursachen können, die zu Krebs führen können.

Verbesserter Ames -Test mit induziertem Hamsterleber S9

Nach den jüngsten Richtlinien der Europäischen Medicines Agency (EMA) ist der traditionelle AMES -Test möglicherweise nicht empfindlich genug, um das mutagene Potenzial bestimmter Nitrosaminverunreinigungen, insbesondere Nitrosodimethylamin (NDMA), nachzuweisen. Daher wurde der vom National Center for Toxicological Research (NCTR), einer Aufteilung der US -amerikanische Food and Drug Administration (FDA), entwickelte erweiterte AMES -Test als zuverlässigere Alternative empfohlen. Der erweiterte AMES -Test führte das Hinzufügen von induziertem Hamsterleber S9 ein, das bei 30% Rattenleber S9 und 30% Hamster Leber S9 durchgeführt wurde. Ratten- und Hamster -Desmosomenüberstände (S9s) sollten aus Nagetierlebern hergestellt werden, die mit Cytochrom -P450 -Enzym - Substanzen behandelt werden. Durch die Verwendung induzierter Hamsterleber S9 simuliert dieser verbesserte Test den menschlichen Stoffwechsel besser und erhöht die Zuverlässigkeit der Ergebnisse.

Abschluss

Die induzierte Rattenleber S9 dient als kritisches Instrument für Genotoxizitätstests und hilft Forschern und Regulierungsbehörden, das mutagene und krebserzeugende Potential von Chemikalien zu bewerten. Durch die Bereitstellung eines metabolischen Aktivierungssystems verbessert es die Fähigkeit von Assays wie den AMES -Test, Mutationstests und CYP450 -Aktivitätsstudien zum Nachweis von Substanzen, die eine metabolische Aktivierung erfordern, um genotoxisch zu werden. Seine Anwendungen sind für die Gewährleistung der Sicherheit neuer Arzneimittel, Chemikalien und Konsumgüter unerlässlich. Mit seiner Rolle bei der Simulation des menschlichen Leberstoffwechsels ist die induzierte Rattenleber -S9 -Fraktion weiterhin ein unverzichtbarer Bestandteil moderner toxikologischer und regulatorischer Sicherheitsbewertungen.