Primäre Hepatozyten: Ein entscheidendes Instrument zur Weiterentwicklung der nicht - klinischen In -vitro -Arzneimittelforschung

Primäre Hepatozyten: Ein entscheidendes Instrument zur Weiterentwicklung der nicht - klinischen In -vitro -Arzneimittelforschung

Leber spielt als primäres Organ für die Arzneimittelexposition eine entscheidende Rolle für den Arzneimittelstoffwechsel und die Toxizitätsprozesse. Primäre Hepatozyten besitzen das gesamte Spektrum von zellulären Eigenschaften und physiologischen Spiegeln von Enzymen und Cofaktoren, einschließlich Membran - gebundene Enzyme wie Cytochrom p450 (eine gemischte Funktionsoxidase in den glatten endoplasmatischen Retikulum) und cytosolischen Esterasen, die alle in der Liver fundierten Metabolen fanden. Aus diesem Grund werden primäre Hepatozyten allgemein als Goldstandard für die Konstruktion von In -vitro -Lebermodellen angesehen und von Forschern in Bezug auf Arzneimittelwechselwirkung, Arzneimittelstoffwechsel und Toxizitätsstudien bevorzugt. Dieser Artikel bietet einen Überblick über 2D- und 3D -Kulturmodelle, die auf primären Hepatozyten und ihren Anwendungen in der Arzneimittelentwicklung basieren.

Schlüsselwörter: Primäre Hepatozyten, 2D -Kultivierung, 3D -Kultivierung, Organoide, CO - Kultur.

1. 1. Isolierung primärer Hepatozyten

Die Isolierung von primären Hepatozyten ist ein kritischer Schritt bei der Festlegung von In -vitro -Lebermodellen, wobei die beiden Stufen -Kollagenase -Perfusionsmethoden am häufigsten verwendet werden. Bei kleineren Tieren kann die Leberperfusion über die Portalvene oder die vena cava inferior durchgeführt werden, während größere Tiere typischerweise eine Perfusion durch Leberlappen oder Segmente benötigen. Mehrere Schlüsselfaktoren beeinflussen die erfolgreiche Isolierung von Hepatozyten: Erstens sollte Kollagenase nicht zytotoxisch sein. Zweitens ist der Zeitpunkt der Verdauung von entscheidender Bedeutung -Sowohl unter - Verdauung als auch über - Verdauung können die Ertrag und Lebensfähigkeit der Hepatozyten beeinträchtigen. Drittens muss der Leberzustand optimal sein, da Hepatozyten sehr empfindlich gegenüber ischämischen Schäden reagieren. Die für die Hepatozytenpräparation verwendete Leber sollte schnell abgekühlt werden, um die Stoffwechselraten zu senken und Stoffwechselhypoxie und anschließende Ischämie zu verhindern.

Die Standards für primäre Hepatozyten, die in der Arzneimittelforschung verwendet werden, sind wie folgt:

1. 2. Primäre Hepatozyten -2D -Kultur

Das Hepatozytenmodell der Suspension

Es enthält vollständige Arzneimittel - metabolisierende Enzyme und Cofaktoren, wodurch es für die Untersuchung verschiedener Stoffwechsel -Clearance -Wege geeignet ist. Die Lebensfähigkeit der Hepatozyten der Suspension und die Aktivität von Arzneimittelmetabolisierungsenzymen nimmt jedoch mit zunehmender In -vitro -Inkubationszeit allmählich ab und begrenzt die Inkubationszeit auf maximal 4 Stunden. Dieses Modell wird typischerweise verwendet, um die Clearance von Arzneimitteln mit mittelschweren bis hohen Clearance -Raten abzuschätzen. Wenn die Clearance -Rate weniger als 20%beträgt, können genaue Clearance -Werte nicht bestimmt werden. Traditionelle Suspensions -Hepatozyten -Basis in vitro -Metabolismusmodellen reichen nicht aus, um nachweisbare Stoffwechselreaktionen für langsame - metabolisierende Verbindungen zu erzeugen, wodurch ihre Fähigkeit zur Vorhersage der Clearance -Raten und Stoffwechselprodukte dieser Verbindungen einschränkt. Eine Hepatozyten -Relaismethode (Abbildung 1) kann verwendet werden, um die Inkubationszeit auf 20 Stunden oder sogar länger zu verlängern.

Anwendung:Enzymaktivität und metabolische Stabilitätsstudien für kleine Moleküle -Arzneimittel.

Abbildung 1. Übertragung des Hepatozyten -Relais -Verfahrens.

Quelle: Drug Metab Dispos, 2012, 40 (9): 1860–1865

Das platzable Hepatozytenmodell

Primäre Hepatozyten werden in einem 2D -System auf kollagenbeschichteten Kulturplatten kultiviert. Die Hepatozyten weisen eine epitheliale Morphologie mit hervorstehenden Kernen auf, die häufig in einer binuklierten Form auftreten. Die Nachteile der Kultur der einzelnen Hepatozytenmonoschicht umfassen: 1. Veränderung der Zellpolarität und -funktion.2. Mangel an anderen relevanten Zelltypen (d. H. Nicht - Parenchymzellen), die für die normale Funktion erforderlich sind.3. Unfähigkeit, ausreichende Nährstoffe und parakrine Faktoren bereitzustellen, um die Hepatozyten bei der Ausführung ihrer Funktionen (wie Gallensäure- und Serumproteinbiosynthese) zu unterstützen.

Anwendungen:

1). Bewertung von Arzneimitteln - Arzneimittelwechselwirkungen:Dies schließt die Enzyminduktion, die Enzymhemmung und die Transporterstudien ein. Wenn ein Medikament als Induktor wirkt, kann es zuerst zu einer erhöhten Expression von Arzneimitteln führen, die Enzyme und Transporter aus metabolisieren. Starke Induktoren können mehrere Gene gleichzeitig hochregulieren, z. Zweitens gibt es Arten - spezifische Unterschiede darin, wie Hepatozyten auf Induktoren reagieren. Zum Beispiel ist Rifampicin ein wirksamer Induktor für Hepatozyten von Menschen und Kaninchen, hat jedoch keinen Induktionseffekt auf Rattenhepatozyten. Schließlich kann die suboptimale Verschleppungsdichte von plattbaren Hepatozyten zu einer verringerten basalen Expression von P450 und künstlich erhöhten Induktionsreaktionen führen. Wie in Abbildung 3 gezeigt, zeigen Hepatozyten bei niedrigeren Überbeamtendichten eine geringere basale Aktivität von CYP1A2, CYP2B6 und CYP3A4, aber stärkere Induktionsreaktionen. Daher sind gesunde Hepatozyten in einer geeigneten Überbeamtendichte erforderlich, um physiologisch relevante Daten zu erhalten.

Abbildung 2. Beziehung zwischen Überlagendichte von kryokonservierten menschlichen Hepatozyten und Enzyminduktion

Quelle: aktuelle Arzneimittelentdeckungstechnologien, 2010, 7: 188 - 198

2). Hepatotoxizitätsbewertung: Beobachten Sie morphologische Veränderungen unter einem Lichtmikroskop wie Zellmorphologie, Vakuol- und Lipidtröpfchenaggregation sowie Zellbefestigung/Ablösung. Nachweis von Hepatozytennekrose (wie durch Aspartataminotransferase, Lactatdehydrogenase und Alanin -Aminotransferase) und Apoptose (DNA -Fragmentierung) angezeigt. Für Zytokin - vermittelte Zytotoxizität können einzelne Monoschichtkulturen von Hepatozyten aufgrund der Regulation durch Substanzen, die aus benachbarten nicht - parenchymalen Zellen wie Kupffer -Zellen, Stellatzellen und sinusoidalen Endothelzellen freigesetzt werden, nicht prognostiziert werden.

3). "Relaismethode" zur Untersuchung der langsamen Metabolisierungs -Verbindungs ​​-Clearance und deren Metaboliten: Die Aktivität des Arzneimittels - Die metabolisierenden Enzyme in plättbaren Hepatozyten beginnt nach 24 Stunden Überlagerung abzubauen. Nach der Inkubation von hepatozyten mit Serum - freiem Medium, das die interessierende Verbindung für 24 Stunden enthält, wird das Medium gesammelt und gemischt und dann für eine weitere Untersuchung auf neue hepatozyten übertragen (Abbildung 3).

Abbildung 3..

Quelle: Drogenstoffwechsel, 2016, 10: 3 - 15

3). Bewerten Sie die zelluläre Aufnahme, die Endozytose, die endosomale Flucht und die Stummschaltung auf das Zielgen von Hepatozyten - gezielten kleinen Nukleinsäure -Arzneimitteln.

Sandwichanbaumodell

In vitro können Hepatozyten zwischen zwei Schichten von Kollagen oder Matrigel kultiviert werden, um in vivo -Strukturen zu rekonstruieren, die als Sandwichanbau bezeichnet werden. Hepatozyten, die zwischen zwei Gel -Kollagen (Sandwichstruktur) kultiviert sind, können die Morphologie und Lebensfähigkeit der Zellen verbessern und ihre Funktionalität über einen längeren Zeitraum aufrechterhalten. Darüber hinaus können Hepatozyten in der Sandwichkultur die Polarität wiederherstellen und eine ordnungsgemäße Lokalisierung basolateraler und kanalikulärer Transporter sowie die Bildung von funktionellen Gallengangsnetzwerken ermöglichen (Abbildung 4).

Abbildung 4. polarisierte Expression von Transportern im menschlichen Hepatozyten -Sandwichmodell

Quelle: Current Drug Discovery Technologies, 2010, 7, 188 - 198

Anwendungen:

1. 1). Schätzung der biliären Ausscheidung von Verbindungen.
2. 2). Bewertung der Leber- und Gallenverteilung endogener und exogener Verbindungen und Metaboliten.
3. 3). Schätzung der Clearance, vermittelt durch Metabolismus und Transporter und konstruiere physiologische pharmakokinetische Modelle.
4. 4). Untersuchung der Hepatotoxizität und Bereitstellung von Mechanismen für klinisches Arzneimittel induzierte Leberverletzung. Die Daten werden in Systeme Pharmakologische Modelle integriert, um potenzielle Arzneimittel induzierte Leberschäden beim Menschen zu vorherzusagen.
5.  
   1. 3.. Primäre Hepatozyten -3D -Kultur

6. In 3D -Kultursystemen werden Hepatozyten in einer drei - dimensionalen Matrix kultiviert, die die In -vivo -Leberarchitektur im Vergleich zu 2D -Monoschichtkulturen besser nachahmt. Diese Systeme fördern die Zell- und Zellmatrix -Wechselwirkungen, die mehr der physiologischen Funktionen der Leber wiederherstellen können, einschließlich Arzneimittelstoffwechsel, Proteinsekretion und Gallenbildung. Primäre Hepatozyten -3D -Kulturen können verwendet werden, um Leber in einer in vivo -ähnlichen Umgebung spezifische Funktionen zu untersuchen und Vorteile für Drogentests, Toxizitätsbewertung und Modellierung von Krankheiten zu bieten.

   Sphäroidmodell

Durch Techniken wie ultra - niedrige Bindungskultur, Hängenabfallkultur und magnetische Zellkultur (Abbildung 5) können primäre Hepatozyten in sphäroidale Aggregate mit einem Durchmesser von bis zu 150 - 175 µm aggregieren, ohne sich auf externe Matrizen zu verlassen. Ein Vorteil der Sphäroidkultur ist, dass jedes Sphäroid nur 1.330 - 2.000 Zellen benötigt, was die Anzahl der Zellen im Vergleich zu anderen 3D -Kulturtechniken signifikant reduziert. Jüngste Studien haben gezeigt, dass primäre Hepatozyten -Sphäroidkulturen bis zu 5 Wochen lang aufrechterhalten werden können, wobei die CYP -Enzymaktivität zwischen Tag 8 und Tag 35 fast unverändert bleibt. Die Proteomikanalyse ergab, dass im Vergleich zu Sandwichkultur die Enzyme, die für die Absorption von Arzneimitteln für die Arzneimittelabsorption verantwortlich ist, in einer Spiegelabsorption, der Verteilung, in der spirituellen Kultur, in der spirituellen Kultur bessere Verantwortung sind. Die Leber ist jedoch viel komplexer als ein Zellaggregat. Die basolaterale Seite der Hepatozyten interagiert mit Blut, während die Galle aus der apikalen Seite fließt, was ein Schlüsselmerkmal der komplexen Leberläudstruktur ist und dies im Sphäroidmodell noch nicht repliziert werden kann.

Anwendungen:

1. 1). Untersuchung der langsamen Metabolisierungs -zusammengesetzten Clearance und deren Metaboliten.
2. 2). Hepatotoxizitätsforschung.
3. 3). Bewertung der zellulären Aufnahme, der Endozytose, der endosomalen Flucht und der Stummschaltung auf Zielgene von Hepatozyten - gezielte kleine Nukleinsäure -Arzneimittel.

Abbildung 5. Sphäroid -Kulturmethode

Modell des Leber Organoide

Die Konsensdefinition von Organoiden lautet: 3D -Strukturen, die aus Stammzellen, Vorläuferzellen oder differenzierten Zellen stammen, die bestimmte Funktionen und Strukturen des nativen Gewebes in vitro reproduzieren und die In -vivo -Mikroumgebung und die Zellwechselwirkungen - Zellen effektiv nachahmt. Leberorganoide wurden als das fortschrittlichste Modell für die Forschung für menschliche Leberbiologie identifiziert.

Zellquellen für die Konstruktion von Leber Organoid:

① Pluripotente Stammzellen (PSCs):

Embryonale Stammzellen (ESCs) und induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) besitzen eine hohe Pluripotenz, Plastizität und unbegrenzte proliferative Kapazität. Unter dem Einfluss spezifischer Signalfaktoren differenzieren sie in hepatozytenähnlichen Zellen mit Aktivität und Funktion. Von PSCs abgeleitete Leberorganoide können jedoch epigenetische und genetische Veränderungen unterzogen werden, die während der Amplifikation chromosomale Aneuploidieänderungen aufweisen.

Anwendungen:

1. 1). Modelle genetischer Lebererkrankungen
2. 2). Infektionsmodelle für Lebererkrankungen
3. 3). Wirkstoffzytotoxizitätstest

② Lebergewebe - abgeleitete Zellen: Dazu gehören Cholangiozyten und Hepatozyten. Reife Hepatozyten behalten das Stammzellpotential und die proliferative Fähigkeit in bestimmten Umgebungen bei. Im Vergleich zu PSC -abgeleiteten Organoiden sind Organoide, die aus primärem Gewebe abgeleitet wurden, ausgereifter, mit stabileren Genomen und beibehalten phänotypischer und genetischer Stabilität während der langen - in vitrokultur. Die longende proliferative Kapazität reifer menschlicher Hepatozyten -Organoide ist jedoch im Vergleich zu fetalen humanen Hepatozyten oder der primären Hepatozyten für erwachsene Maus begrenzt. Die Kultivierung von Hepatozyten -Organoiden für Erwachsene bleibt eine Herausforderung.

Kulturmethode (Abbildung 6): Das Lebergewebe wird in einzelne Zellen verdaut, und eine Mischung aus Matrigel und Zellen wird in einer 24 - Bohrlochplatte ausgesät, um kuppelförmige Strukturen zu bilden. In einem Zellkultur -Inkubator (37 ° C) 15 Minuten inkubieren. Fügen Sie nach der Verfestigung spezifisches Kulturmedium hinzu. Durchgang nach ungefähr 14 Tagen. Ersetzen Sie das ursprüngliche Medium nach 7 - 10 Tagen durch Differenzierungsmedium.

Anwendungen:

1. 1). Hepatotoxizitätsmodelle
2. 2). In -vitro -Stoffwechselstudien
3. 3). Nicht - alkoholische Fettlebererkrankung
4. 4). Drogenentwicklung für gutartige und bösartige Lebererkrankungen

Abbildung 6. Kultur- und Durchgangsprozess des Gewebes - abgeleitete Leber Organoide

Quelle: Cell & Bioscience (2023) 13: 197: 197

Vergleich der Kugelkultur und der Organoidkultur

4. Primäres Hepatozyten -Kulturmodell

1. 1. 2D Primäres Hepatozyten -Kulturmodell
      

      Im 2D -Primär -Hepatozyten -Kulturmodell werden zwei oder mehr verschiedene Zelltypen in einer zwei - dimensionalen Umgebung gemischt und kultiviert. Das Schlüsselmerkmal dieses Modells ist die direkte Wechselwirkung zwischen verschiedenen Zelltypen, der Wechselwirkung zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix oder der indirekten Signalübertragung über Zytokine und chemische Kommunikation. Primäre Hepatozytenfunktionen wie Albuminproduktion und Fähigkeit zur Arzneimittelstoffwechsel können bis zu drei Wochen lang beibehalten werden.

      Anwendungen:

      1. 1). Primäre Hepatozyten, die mit Fibroblasten kultiviert sind: Dieses Modell wird zur Untersuchung der Clearance -Rate langsamer - metabolisierender Verbindungen und ihrer Metaboliten verwendet.
      2. 2). Primäre Hepatozyten, die mit nicht - parenchymalen Leberzellen (z. B. Sternzellen, sinusoide Endothelzellen) kultiviert wurden: Dieses Modell ist nützlich für die Erforschung von Arzneimitteln - induzierte Leberverletzung (DILI), da es zur Untersuchung der Rolle von Zytokinen, Chemokinen und Wachstumsfaktoren bei der Veränderung von Liver -Anpassungsreaktionen nach dem Wirkstoff nach der Wirklichkeit hilft.
      3. 3). Primäre Hepatozyten, die mit T -Zellen kultiviert sind: Dieses Modell wird verwendet, um den Leber -Arzneimittelstoffwechsel zu erkennen - Spezifische T -Zell -Reaktionen.
      4. 4). Iphase's Hepatomax ™CO - Culture System: Iphase hat ein CO - Kultursystem mit primären Hepatozyten aus verschiedenen Arten entwickelt, die als Hepatomax bekannt sind™. Durch die Kultivierung des menschlichen primären Hepatozyten mit Stromazellen ist es möglich, ein gutes Medikament für bis zu 3 Wochen in menschlichen Hepatozyten aufrechtzuerhalten. Dieses System eignet sich zur Untersuchung der langsamen Metabolisierungsrate und deren Metaboliten.

      Dieses Kulturmodell bietet eine physiologisch relevantere Plattform für die Beurteilung des Arzneimittelstoffwechsels, der Toxizität und der Leber -- -verwandten Krankheitsprozesse und bietet Einblicke in die Art und Weise, wie unterschiedliche Zelltypen zur Leberfunktion und -krankheit beitragen.
      
      

      3D Primäres Hepatozyten -Kulturmodell

      Direkte 3D Co - Kultur: Dieses Modell beinhaltet das Mischen von zwei oder mehr verschiedenen Arten von Leberzellen (z. B. primäre Hepatozyten, sinusoide Endothelzellen, Leber -Sternzellen, Kupffer -Zellen), um selbst zusammengebaute Sphäroide oder Co -Kultivierungen in einer 3D -Umgebung zu bilden, die mit Materialien wie Kollagen, Fibin, Algin, Algin oder Hydrogelen konstruiert ist. Die direkte 3D -Kultur ermöglicht eine enge Wechselwirkung zwischen verschiedenen Leberzellen durch Mechanismen wie Zelle - bis - Zelladhäsion, parakrine Signalübertragung über lösliche Zytokine und extrazelluläre Matrixadhäsion, die die Kommunikation zwischen Hepatozyten ermöglichen.

      Anwendungen:

      1. 1). Leberfibrosemodell: Wird verwendet, um die Mechanismen und das Fortschreiten der Leberfibrose zu untersuchen.
      2. 2). DILI -Modell (Arzneimittel induzierte Leberschäden): Hilft bei der Simulation und Bewertung von Leberschäden durch Arzneimittel.
      3. 3). Arzneimittelwechselwirkungen, Arzneimittelstoffwechsel und Enzyminduktion: Bewertet, wie unterschiedliche Arzneimittel interagieren, wie sie metabolisiert werden und wie sie Leberenzyme induzieren.

      Indirekte 3D -Kultur: Diese Methode verwendet ein physikalisches Trennsystem (z. B. Transwell oder andere Materialien), um zwei oder mehr Zellenarten (z. B. primäre Hepatozyten mit NIH/3T3 -Zellen oder sinusoidalen Endothelzellen) in einer 3D -Umgebung zu kulturellen, in der die direkte Zelle - zu Zellkontakt verhindert wird. Die Kommunikation zwischen den Zellen erfolgt über lösliche Zytokine.

      Anwendungen:
      Wird zur Untersuchung der Nicht -- -Kontakt -Kommunikation zwischen Leberzellen im Körper verwendet.

      
      Zusammenfassend liefert iPhase als Leiter in der biologischen In -vitro -Forschung umfassende Lösungen für nicht - klinische Drogentests. Von der Isolation und Kultur primärer Hepatozyten von verschiedenen Arten bis zur Entwicklung von unterstützenden Produkten wie Kulturmedien für spezifische Anwendungen oder Multi -- -Spezifikationskollagen - beschichtete Platten ist iPhase gewidmet, um die besten In -vitro -Forschungsinstrumente für die Entdeckung und Entwicklung von Arzneimitteln anzubieten. Wir sind ein vertrauenswürdiger Partner für Kunden in der Pharmaindustrie, der sich der Bereitstellung von Schnittlösungen für die nicht - klinische Forschung einsetzt.