Induktita rato hepato S9 -frakcio: metabola aktiviga sistemo por in vitro genotoxicidad kaj mutaciotestoj

Ŝlosilvortoj: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, Mutacio -testo, genotoxicidad, genetika tokseco, induktita rato hepato S9, Ames -testo, mini ames -testo, kromosoma aberado, mikronucleus, HPRT/HGP -testado, T -a testado.

Produkto de ifase

Enkonduko

Induktita rato hepato S9estas ŝlosila ero por taksi laGenetika toksecopotencialo de kemiaĵoj, precipe en reguliga toksologio. Ĝi estas ofte uzata en kombinaĵo kun in vitro -provoj, kiel laAmes -testo KajMutaciaj provoj, por taksi la mutagenajn proprietojn de komponaĵoj. Provizante enzimatan sistemon riĉan en citokroma P450 (CYP450), la induktita rato hepato S9 -frakcio ludas gravegan rolon en simulado de la metabolaj procezoj okazantaj en la hepato, helpante determini ĉu kemiaĵoj povas kaŭzi genetikajn mutaciojn aŭ kanceron.

Induktita rato hepato S9

La frakcio de hepato S9 rilatas al post - mitokondria supernatanto akirita de rato -hepataj homogenoj post serio de centrifugaj paŝoj. La esprimo "induktita" rilatas al la traktado de ratoj kun specifaj komponaĵoj, kiuj plibonigas la agadon de hepataj enzimoj, aparte la citokromaj P450 -enzimoj (CYP450), kiuj respondecas pri la metabolo de vasta gamo de ksenobiotoj.

La induktita rato hepato S9 -frakcio enhavas diversajn enzimojn, kiuj estas implikitaj en la fazo I kaj fazo II metabolo de kemiaĵoj. Ĉi tio inkluzivas enzimojn kiel citokromaj P450 -monooxigenasoj, kiuj faciligas oksidan biotransformadon de substratoj, tiel imitante homan hepatan metabolon.

CYP450 -agado kaj metabola aktivado

La citokroma P450 -enzima familio (CYP450) ludas pivotan rolon en la metabolo de ampleksa vario de substancoj, inkluzive de multaj farmaciaĵoj, mediaj kemiaĵoj kaj karcinogenoj. La induktita rato hepato S9 -frakcio enhavas ĉi tiujn enzimojn kaj estas esenca por taksi kemiaĵojn, kiuj eble nur fariĝos genotoksaj post metabola aktivado.

Multaj komponaĵoj estas komence ne - toksaj sed povas fariĝi toksaj post metabolo en la hepato. Ĉi tiuj pro - mutagens (kiuj postulas metabolan aktivadon fariĝi mutagenaj) kaj pro - karcinogenoj (kiuj postulas aktivigon kaŭzi kanceron) nur povas esti detektitaj per provoj, kiuj inkluzivas S9 -metabolan aktivigan sistemon. Sen la indukto de metabolaj enzimoj kiel CYP450, ĉi tiuj substancoj povas ŝajni sendanĝeraj en normaj genotoxicity -provoj.

Aldonante induktitan ratan hepaton S9 al in vitro -provoj, esploristoj povas taksi kiel substanco interagas kun la CYP450 -enzimoj. Ĉi tio estas aparte grava por farmaciaĵoj, ĉar metabolo de CYP450 -enzimoj estas kritika paŝo en la farmacokinetiko de multaj drogoj.

Aplikoj de induktita rato hepato S9

1. 1. Ames -testo (OECD 471)

La testo de Ames, skizita en gvidlinioOECD 471, estas unu el la plej bone - konataj kaj vaste uzataj metodoj por taksi mutagenecon. Ĝi implikas eksponi streĉojn de salmonelaj bakterioj al testo -kemiaĵo por vidi ĉu ĝi induktas mutaciojn kaŭzantajn la bakteriojn reveni al histidino - sendependa stato.

Por simuli la homan metabolan procezon, induktita rato hepato S9 ofte estas aldonita al la testosistemo. La S9 -frakcio disponigas la necesajn enzimojn, inkluzive de CYP450, kiu povus esti bezonata por metaboligi la komponaĵon en pli reaktivan formon, kiu povus kaŭzi mutaciojn en la bakteria DNA. Ĉi tiu kombinaĵo de S9 kun la testo Ames permesas pli ampleksan taksadon de mutagena potencialo imitante ambaŭ rektajn kaj metabolajn aktivigitajn mutagenajn mekanismojn.

2. 2.Mutaciaj testoj (kromosoma aberacia testo, mikronuklea testo, kaj aliaj in vitro -provoj)

Krom la testo de Ames, mutaciotestoj estas ofte uzataj por taksi la genotoksan potencialon de kemiaĵoj. Ĉi tiuj provoj estas pli ampleksaj por taksi gamon da genetikaj damaĝoj, inkluzive de kromosomaj mutacioj, genaj mutacioj kaj formado de mikronukleoj. Induktita Rato -Hepato S9 estas uzata en mutaciaj provoj pro la sekvaj kialoj:

Mikronuklea testo (OECD 487)

Ĉi tiu provo detektas la formadon de mikronukleoj en ĉeloj, kiuj estas malgrandaj, ekstranukleaj korpoj enhavantaj fragmentojn de kromosomoj aŭ tutaj kromosomoj, kiuj ne estis enmetitaj al la kerno dum ĉela divido. La Mikronuklea testopovas detekti klastogenajn (kromosomajn - rompi) kaj aneugenajn (tuŝante kromosomajn nombrojn) efikojn. Induktita rato hepato S9 estas uzata ĉi tie por aktivigi la testan substancon metabole, ĉar iuj kemiaĵoj nur kaŭzas kromosoman damaĝon post kiam ili estis metaboligitaj de hepataj enzimoj. La S9 -frakcio plibonigas la sentivecon de la testo simulante la metabolan aktivadon, kiu povas okazi en vivo.

Kromosoma aberacia testo (OECD 473)

Ĉi tiu testo taksas, ĉu substanco povas kaŭzi strukturajn damaĝojn al kromosomoj per induktado de paŭzoj, forigoj, translokigoj aŭ aliaj specoj de aberacioj. Kiel la Mikronuklea testo, laKromosoma aberacia testopovas esti aplikata kun aŭ sen metabola aktivado. Induktita rato hepato S9 estas aldonita al la testosistemo por imiti la metabolajn procezojn en la hepato, permesante taksi substancojn, kiuj eble ne kaŭzos kromosoman damaĝon en sia originala formo, sed povus fari tion post hepata metabolo.

Tabelo 1. Komparataj Konsideroj de Mutaciaj Provoj

HPRT/HGPRT -provo (OECD 476)

En laHPRT/HGPRT -provo, kulturoj de ĉina hamstro (CHO aŭ V79) aŭ homaj limfoblastoidaj (TK6) ĉeloj estas elmontritaj al la testo -kemiaĵo en ĉeesto de induktita rato hepato S9 metabola miksaĵo, kiu liveras CYP450 -enzimojn bezonatajn por konverti pro -mutens en DNA -reaktivajn speciojn. Post mallonga kuracado kaj sep -taga esprimo, ĉeloj estas defiitaj per 6 -tioguanino; Nur klonoj portantaj perdo -funkciajn mutaciojn en la hipoksantino -guanina fosforibosiltransferasa geno postvivas. Komparante mutajn koloniajn kalkulojn al entuta farebleco, esploristoj determinas mutacion -frekvencon, kiu, se reprodukteble levita super ambaŭ samtempaj kaj historiaj kontroloj, indikas genotoksan potencialon.

TK -testoj (OECD 490 & OECD 476)

LaTK -provo uzas aŭ L5178Y musajn limfomajn ĉelojn (OECD 490) aŭ CHO -ĉelojn (OECD 476) inĝeniera heterozigoto ĉe la timidina kinasa loko. Post kemia ekspozicio ± S9 -miksaĵo, ĉeloj resaniĝas kaj estas tegitaj en meza enhavanta trifluorotimidinon, kiu mortigas TK -efikajn ĉelojn. Postvivantaj tk⁻ -mutantoj formas koloniojn dum 10-14 tagoj, kun malgrandaj -kolonaj mutantoj ofte reflektantaj kromosomajn eventojn kaj grandajn kolonajn mutantojn reflektantajn punktajn mutaciojn. Kiel en la provo de HPRT/HGPRT, striktaj citotoksecaj kontroloj kaj pozitivaj mutagenaj referencoj certigas, ke observitaj pliigoj en mutaciofrekvenco fidinde reflektas la genotoksan riskon de komponaĵo.

4. 4. Kancera Riska Takso

Induktita rato hepato S9 ankaŭ estas uzata en studoj celantaj taksi la kanceron - kaŭzante potencialon de substancoj. Simulante la metabolajn procezojn okazantajn en la homa hepato, la S9 -frakcio povas helpi identigi komponaĵojn, kiuj povus konduki al formado de reaktivaj metabolitoj kapablaj ligi al DNA kaj kaŭzi mutaciojn, kiuj povus konduki al kancero.

Plibonigita Ames -testo kun induktita hamster hepato S9

Laŭ la plej novaj gvidlinioj elsenditaj de la Eŭropa Agentejo pri Medikamentoj (EMA), la tradicia Ames -testo eble ne estas sufiĉe sentema por detekti la mutagenan potencialon de certaj N - nitrosaminaj malpuraĵoj, precipe N - nitrosodimetilamina (NDMA), inter aliaj. Tial, la plibonigita AMES -testo, disvolvita de la Nacia Centro por Toksikologia Esploro (NCTR), divido de la Usona Manĝaĵo kaj Drogadministrado (FDA), estis rekomendita kiel pli fidinda alternativo. La plibonigita testo Ames enkondukis aldonon de induktita hamster -hepato S9, kiu agis en enhavo de 30% rato hepato S9 kaj 30% hamster hepato S9. Rato kaj hamster desmosomaj supernatantoj (S9s) devas esti preparitaj el ronĝuloj de ruĝuloj traktitaj kun citokroma P450 -enzimo - induktaj substancoj. Uzante induktitan hamstran hepaton S9, ĉi tiu plibonigita testo pli bona simulas homan metabolon kaj pliigas la fidindecon de la rezultoj.

Konkludo

Induktita Rato -Hepato S9 servas kiel kritika ilo en genotoxicity -testado, helpante esploristojn kaj reguligajn agentejojn taksi la mutagenan kaj karcinogenan potencialon de kemiaĵoj. Provizante metabolan aktivigan sistemon, ĝi plibonigas la kapablon de provoj kiel la testo de Ames, mutacio -provoj kaj CYP450 -aktivecaj studoj por detekti substancojn, kiuj postulas metabolan aktivadon por fariĝi genotoksaj. Ĝiaj aplikoj estas esencaj por certigi sekurecon de novaj drogoj, kemiaĵoj kaj konsumaj produktoj. Kun sia rolo en simulado de homa hepata metabolo, la induktita rato hepato S9 -frakcio daŭre estas nemalhavebla parto de moderna toksologio kaj reguligaj sekurecaj taksoj.