Primaraj hepatocitoj: Kerna ilo por progresi ne - Klinika In vitro -Droga Esploro

Primaraj hepatocitoj: Kerna ilo por progresi ne - Klinika In vitro -Droga Esploro

Hepato, kiel la ĉefa organo por ekspozicio al drogoj, ludas gravegan rolon en procezoj de metabolo kaj toksikeco de drogoj. Primaraj hepatocitoj posedas la plenan spektron de ĉelaj trajtoj kaj fiziologiajn nivelojn de enzimoj kaj koaktoroj, inkluzive de membrano - ligitaj enzimoj kiel citokroma P450 (miksita - funkcio oksidase en la glata endoplasma retikulo) kaj citosolaj esterasoj, ampleksante ĉiujn metatabolajn vojojn en la libolaj vojoj de la metabolo. Por tio, primaraj hepatocitoj estas vaste konsiderataj kiel la ora normo por konstruado de in vitro -hepataj modeloj kaj estas favoritaj de esploristoj pri interagado de drogoj, metabolo de drogoj kaj studoj pri tokseco. Ĉi tiu artikolo donas superrigardon de 2D kaj 3D -kulturmodeloj bazitaj sur primaraj hepatocitoj kaj iliaj aplikoj en drog -disvolviĝo.

Ŝlosilvortoj: Primaraj hepatocitoj, 2D -kultivado, 3D -kultivado, organoidoj, CO - kulturo.

1. 1. Izolado de primaraj hepatocitoj

La izolado de primaraj hepatocitoj estas kritika paŝo por establi in vitro -hepatajn modelojn, kun la du - Paŝa Kolagenasa Perfuza Metodo esti la plej ofte uzata. En pli malgrandaj bestoj, hepata perfuzo povas esti farita per la portala vejno aŭ malsupera vena cava, dum pli grandaj bestoj kutime postulas perfuzon tra hepataj loboj aŭ segmentoj. Pluraj ŝlosilaj faktoroj influas la sukcesan izoladon de hepatocitoj: unue, kolagenase devas esti ne - citotoksaj. Due, la tempigo de digesto estas kerna -Ambaŭ sub - digesto kaj super - digesto povas kompromiti hepatocitan rendimenton kaj fareblecon. Trie, la hepata kondiĉo devas esti optimuma, ĉar hepatocitoj estas tre sentemaj al iskemia damaĝo. La hepato uzata por preparado de hepatocitoj devas esti rapide malvarmetigita por redukti metabolajn tarifojn kaj malhelpi metabolan hipoksion kaj postan iskemion.

La normoj por primaraj hepatocitoj uzataj en drogaj esploroj estas kiel sekvas:

1. 2. Primara hepatocito 2D -kulturo

La suspenda hepatocita modelo

Ĝi enhavas kompletan drogon - metaboligantaj enzimoj kaj koaktoroj, igante ĝin taŭga por studado de diversaj metabolaj malplenigaj vojoj. Tamen, la farebleco de suspensaj hepatocitoj kaj la agado de drogaj - metaboligantaj enzimoj iom post iom malpliiĝas dum la in vitro -inkuba tempo pliiĝas, limigante la inkuban tempon ĝis maksimume 4 horoj. Ĉi tiu modelo estas tipe uzata por taksi la malplenigon de drogoj kun modera ĝis alta malplenigo. Kiam la malpleniga indico estas malpli ol 20%, precizaj malplenigaj valoroj ne povas esti determinitaj. Tradicia suspendo hepatocito - bazitaj en vitro -metabolaj modeloj estas nesufiĉaj por generi detekteblajn metabolajn reagojn por malrapidaj - metaboligantaj komponaĵoj, tiel limigante sian kapablon antaŭdiri la malplenigajn ritmojn kaj metabolajn produktojn de ĉi tiuj komponaĵoj. Suspenda hepatocita relajso -metodo (Figuro 1) povas esti uzata por plilongigi la inkuban tempon ĝis 20 horoj aŭ eĉ pli longe.

Apliko:Enzima agado kaj metabolaj stabilecaj studoj por malgrandaj molekulaj drogoj.

Figuro 1. Suspendo Hepatocita relaja metodo -translokiga procezo

Fonto: Drug Metab Dispos, 2012,40 (9): 1860-1865

La platebla hepatocita modelo

Primaraj hepatocitoj estas kultivitaj en 2D -sistemo sur kolageno - tegitaj kulturplatoj. La hepatocitoj montras epitelian morfologion, kun protrudaj kernoj, ofte prezentantaj en binukleita formo. La malavantaĝoj de ununura hepatocita monokapa kulturo inkluzivas: 1. Alterado de ĉela polareco kaj funkcio.2. Manko de aliaj koncernaj ĉelaj tipoj (t.e., ne - parenkimaj ĉeloj), kiuj estas bezonataj por normala funkcio.3. Nekapablo provizi sufiĉajn nutraĵojn kaj paracrinajn faktorojn por subteni la hepatocitojn en plenumado de iliaj funkcioj (kiel bilia acido kaj seruma proteina biosintezo).

Aplikoj:

1). Taksado de Drogoj - Drogaj Interagoj:Ĉi tio inkluzivas enziman indukton, enzimon -inhibicion kaj transportajn studojn. Unue, kiam drogo agas kiel induktilo, ĝi povas konduki al pliigita esprimo de drogo - metaboligantaj enzimoj kaj transportiloj. Fortaj induktiloj povas reguligi multoblajn genojn samtempe, kiel ekzemple fenobarbita indukto de CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT, kaj pluraj transportaj proteinoj kiel MRP2. Due, estas specioj - specifaj diferencoj pri kiel hepatocitoj respondas al induktiloj. Ekzemple, rifampicino estas efika induktilo por homaj kaj kuniklaj hepatocitoj, sed havas neniun induktan efikon al rataj hepatocitoj. Fine, suboptimaj plataj densecoj de plataj hepatocitoj povas konduki al reduktita baza esprimo de P450s kaj artefarite pliigitaj induktaj respondoj. Kiel montrite en Figuro 3, hepatocitoj ĉe pli malaltaj plataj densecoj montras pli malaltan bazan agadon de CYP1A2, CYP2B6, kaj CYP3A4, sed pli fortajn induktajn respondojn. Tial, sanaj hepatocitoj ĉe taŭga plata denseco estas necesaj por akiri fiziologie gravajn datumojn.

Figuro 2. Rilato inter platiga denseco de kriopreservitaj homaj hepatocitoj kaj enzima indukto

Fonto: Aktualaj Teknologioj pri Malkovro de Drogoj, 2010, 7: 188 - 198

2). Hepatotoxicity -takso: Observante morfologiajn ŝanĝojn sub malpeza mikroskopo, kiel ĉela morfologio, vakuolo kaj lipida guteta agregado, kaj ĉela alligiteco/taĉmento. Detekto de hepatocita nekrosis (kiel indikite per aspartata aminotransferase, lakta dehidrogenazo kaj alanina aminotransferase) kaj apoptozo (DNA -fragmentiĝo). Por citokino - mediata citotokseco, unuopaj monokapa kulturoj de hepatocitoj ne povas antaŭdiri toksajn respondojn pro la regulado per substancoj liberigitaj de najbaraj ne - parenkimaj ĉeloj, kiel Kupffer -ĉeloj, stelaj ĉeloj kaj sinusoidaj endoteliaj ĉeloj.

3). "Relay -metodo" por studo de malrapida metaboliga komponaĵo kaj ĝiaj metabolitoj: La agado de drogo - metaboligantaj enzimoj en plataj hepatocitoj komencas malpliiĝi post 24 horoj de platado. Post inkubado de plataj hepatocitoj kun serumo - senpaga mediumo enhavanta la komponaĵon de intereso dum 24 horoj, la mediumo estas kolektita kaj miksita, poste transdonita al novaj plataj hepatocitoj por plua studo (Figuro 3).

Figuro 3.

Fonto: Leteroj pri Drogaj Metaboloj, 2016, 10: 3 - 15

3). Taksi la ĉelan kaptiĝon, endokitozon, endosoman eskapon kaj silentigajn efikojn sur la cela geno de hepatocito - celitaj malgrandaj nukleaj acidaj drogoj.

Sandviĉa kultivmodelo

In vitro, hepatocitoj povas esti kultivitaj inter du tavoloj de kolageno aŭ Matrigel por rekonstrui en vivo strukturojn, konatajn kiel sandviĉo. Hepatocitoj kultivitaj inter du tavoloj de ĝelo - kolageno (sandviĉa strukturo) povas plibonigi la morfologion kaj fareblecon de la ĉeloj, kaj konservi sian funkciecon dum pli longa periodo. Plue, hepatocitoj en sandviĉa kulturo povas restarigi polarecon, ebligante taŭgan lokalizadon de bazolateralaj kaj kanalaj transportiloj, same kiel la formadon de funkciaj biliaj duktaj retoj (Figuro 4).

Figuro 4. Polarigita esprimo de transportiloj en la homa hepatocita sandviĉa modelo

Fonto: Aktualaj Teknologioj pri Malkovro de Drogoj, 2010, 7, 188 - 198

Aplikoj:

1. 1). Taksante bilian ekskrecion de komponaĵoj.
2. 2). Taksi la hepatan kaj bilian distribuon de endogenaj kaj ekzogenaj komponaĵoj kaj metabolitoj.
3. 3). Kalkulado de malplenigo mediaciita de metabolo kaj transportiloj, kaj konstruanta fiziologion - bazitaj farmacokinetiaj modeloj.
4. 4). Studado de hepatotoxicity kaj provizanta mekanismojn por klinika drogo - induktita hepata vundo. Datumoj estas integritaj en sistemaj farmakologiaj modeloj por antaŭdiri eblajn drogojn - induktitan hepatan vundon en homoj.
5.  
   1. 3. Primara hepatocito 3D kulturo

6. En 3D -kultursistemoj, hepatocitoj estas kultivitaj en tri - dimensia matrico, kiu pli bone imitas la en vivo hepatan arkitekturon kompare al 2D -monokapa kulturoj. Ĉi tiuj sistemoj antaŭenigas ĉelon - ĉelo kaj ĉelo - matricaj interagoj, kiuj povas restarigi pli da fiziologiaj funkcioj de la hepato, inkluzive de drog -metabolo, sekrecio de proteinoj kaj formado de galo. Primaraj hepatocitaj 3D -kulturoj povas esti uzataj por studi hepaton - specifaj funkcioj en pli en vivo - kiel medio, ofertante avantaĝojn por testado de drogoj, takso de toksikeco kaj modelado de malsano.

   Sferoida modelo

Per teknikoj kiel Ultra - Malalta Aldona Kulturo, Hanging Drop Culture, kaj Magneta Ĉela Kulturo (Figuro 5), primaraj hepatocitoj povas agregi en sferoidaj agregoj kun diametro de ĝis 150 - 175 µm sen fidi je eksteraj matricoj. Unu avantaĝo de sferoida kulturo estas, ke ĉiu sferoido postulas nur 1.330 - 2.000 ĉelojn, reduktante signife la nombron de ĉeloj kompare al aliaj 3D -kulturteknikoj. Lastatempaj studoj montris, ke primaraj hepatocitaj sferoidaj kulturoj povas daŭri ĝis 5 semajnoj, kun CYP -enzima agado restanta preskaŭ senŝanĝa inter la tago 8 kaj tago 35. Analizo de proteomikoj malkaŝis, ke kompare kun sandviĉa kulturo, enzimoj respondecaj pri 14 tagoj de la kulturo de drogoj, metabolo. Tamen la hepato estas multe pli kompleksa ol ĉela agregato. La bazolatera flanko de hepatocitoj interagas kun sango, dum la galo elfluas el la apika flanko, kiu estas ŝlosila trajto de la kompleksa hepata lobula strukturo, kaj ĉi tio ankoraŭ ne povas esti replikita en la sferoida modelo.

Aplikoj:

1. 1). Studo pri malrapida metaboliga komponaĵo kaj ĝiaj metabolitoj.
2. 2). Esploro pri hepatotoxicity.
3. 3). Taksado de ĉela konsumado, endokitozo, endosoma fuĝo kaj silentigaj efikoj sur celaj genoj de hepatocito - celis malgrandajn nukleajn acidajn drogojn.

Figuro 5. Sferoida Kulturmetodo

Modelo de hepataj organoidoj

La konsento -difino de organoidoj estas: 3D strukturoj derivitaj de staminaj ĉeloj, pragenaj ĉeloj aŭ diferencitaj ĉeloj, kapablaj reprodukti certajn funkciojn kaj strukturojn de la denaska histo in vitro, efike imitante la en vivo mikroambienton kaj ĉelon - al - ĉelaj interagoj. Hepataj organoidoj estis identigitaj kiel la plej progresinta modelo por esplorado pri homa hepata biologio.

Ĉelaj fontoj por hepata organoida konstruado:

① Pluripotentaj Stemaj Ĉeloj (PSCoj):

Embriaj staminaj ĉeloj (ESCoj) kaj induktitaj pluripotentaj ĉeloj (iPSCoj) posedas altan pluripotencon, plasticecon kaj senliman proliferan kapablon. Sub la influo de specifaj signalaj faktoroj, ili diferencas en hepatocito - kiel ĉeloj kun aktiveco kaj funkcio. Tamen, hepataj organoidoj derivitaj de PSC -oj povas suferi epigenetikajn kaj genetikajn ŝanĝojn, elmontrante kromosomajn aneŭploidajn ŝanĝojn dum amplifado.

Aplikoj:

1. 1). Modeloj de genetika hepatmalsano
2. 2). Infektaj hepatmalsanoj modeloj
3. 3). Testado de drogaj citotoksecoj

② Hepata histo - Derivitaj ĉeloj: Ĉi tiuj inkluzivas kololangiocitojn kaj hepatocitojn. Maturaj hepatocitoj konservas potencialon de ĉeloj kaj prolifera kapablo en specifaj medioj. Kompare kun PSC - Derivitaj organoidoj, organoidoj derivitaj de primara histo estas pli maturaj, kun pli stabilaj genomoj, kaj konservas fenotipan kaj genetikan stabilecon dum longa - termino in vitro -kulturo. Tamen, la longa - termino prolifera kapablo de maturaj homaj hepatocitaj organoidoj estas limigita kompare al fetaj homaj hepatocitoj aŭ plenkreskaj musaj primaraj hepatocitoj. Kulturado de plenkreskaj hepatocitaj organoidoj restas malfacila.

Kulturmetodo (Figuro 6): Hepata histo estas digestita en unuopajn ĉelojn, kaj miksaĵo de Matrigel kaj ĉeloj estas semita en 24 - puto por formi kupolajn strukturojn. Kubu en ĉelkultura inkubatoro (37 ° C) dum 15 minutoj. Post solidigo, aldonu specifan kulturmedion. Pasejo post proksimume 14 tagoj. Remetu la originalan mediumon per diferenciga rimedo post 7 - 10 tagoj.

Aplikoj:

1. 1). Hepatotoxicity -modeloj
2. 2). Studoj pri in vitro -metabolo
3. 3). Ne - alkohola grasa hepata malsano
4. 4). Droga disvolviĝo por benignaj kaj malignaj hepataj malsanoj

Figuro 6.

Fonto: Ĉelo kaj Bioscienco (2023) 13: 197

Komparo de sferoida kulturo kaj organoida kulturo

4. Primara Hepatocito Co - Kulturmodelo

1. 1. 2D Primara Hepatocito Co - Kulturmodelo
      

      En la 2D primara hepatocito Co - kulturmodelo, du aŭ pli malsamaj ĉelaj tipoj estas miksitaj kaj kultivitaj en du - dimensia medio. La ŝlosila trajto de ĉi tiu modelo estas la rekta interagado inter malsamaj ĉelaj tipoj, la interagado inter ĉeloj kaj la eksterĉela matrico, aŭ la nerekta signal -transdono per citokinoj kaj kemiaj konektoj. Primaraj hepatocitaj funkcioj, kiel produktado de albumino kaj drog -metabola kapablo, povas konserviĝi ĝis tri semajnoj.

      Aplikoj:

      1. 1). Primaraj hepatocitoj ko - kulturitaj kun fibroblastoj: Ĉi tiu modelo estas uzata por studi la malplenigan indicon de malrapidaj - metaboligaj komponaĵoj kaj iliaj metabolitoj.
      2. 2). Primaraj hepatocitoj ko - kultivitaj kun ne - parenkimaj hepataj ĉeloj (t.e., stelaj ĉeloj, sinusoidaj endoteliaj ĉeloj): Ĉi tiu modelo estas utila por esplorado de drogo - induktita hepato -vundo (DILI), ĉar ĝi helpas esplori la rolon de citokinoj, kemokinoj kaj kreskaj faktoroj en modulado de vivaj adaptaj respondoj.
      3. 3). Primaraj hepatocitoj ko - kulturitaj kun T -ĉeloj: Ĉi tiu modelo estas uzata por detekti hepatan drogan metabolon - specifaj respondoj de ĉeloj T.
      4. 4). Hepatomax ™ de IphaseCO - Kultursistemo: IPHase disvolvis ko - kulturan sistemon kun primaraj hepatocitoj el diversaj specioj, nomataj hepatomax™. Per co - kulturado de homaj primaraj hepatocitoj kun stromaj ĉeloj, eblas konservi bonan drogon - metaboligante enziman agadon en homaj hepatocitoj dum ĝis 3 semajnoj. Ĉi tiu sistemo taŭgas por studi malrapidajn - metaboligajn kunmetaĵojn kaj iliajn metabolitojn.

      Ĉi tiu modelo CO - Kulturo provizas pli fiziologie gravan platformon por taksi drogajn metabolojn, toksecon kaj hepatajn - rilatajn malsanajn procezojn, ofertante komprenojn pri kiel malsamaj ĉelaj tipoj kontribuas al hepata funkcio kaj malsano.
      
      

      3D Primara Hepatocito Co - Kulturmodelo

      Rekta 3d co - kulturo: Ĉi tiu modelo implikas miksi du aŭ pli malsamajn specojn de hepataj ĉeloj (t.e., primaraj hepatocitoj, sinusoidaj endoteliaj ĉeloj, hepataj stelaj ĉeloj, Kupffer -ĉeloj) por formi sin - kunmetitaj sferoidoj aŭ kunulado de ili en 3D -medio konstruita kun materialoj kiel kolageno, fibrino, alugin, ORIDELO, ORILOGELO, ORILOGELO, ORILOGEL, ORIDELO, ORILOGELO, ORIDELO, ORIDELO. Rekta 3D CO - kulturo permesas proksiman interagadon inter malsamaj hepataj ĉeloj per mekanismoj kiel ĉelo - al - ĉela adhesio, paracrina signalado per solveblaj citokinoj, kaj eksterĉela matrico -adhero, ebligante komunikadon inter hepatocitoj.

      Aplikoj:

      1. 1). Modelo de hepata fibrozo: uzata por studi la mekanismojn kaj progresadon de hepata fibrozo.
      2. 2). Drogo - Induktita hepata vundo (DILI) Modelo: Helpas simuli kaj taksi hepatan damaĝon kaŭzitan de drogoj.
      3. 3). Drogaj interagoj, drog -metabolo kaj enzima indukto: taksas kiel malsamaj drogoj interagas, kiel ili estas metaboligitaj, kaj kiel ili induktas hepatajn enzimojn.

      Nerekta 3D Co - Kulturo: Ĉi tiu metodo uzas fizikan apartigan sistemon (ekz., Transwell aŭ aliajn materialojn) por kulturi du aŭ pli da specoj de ĉeloj (kiel primaraj hepatocitoj kun NIH/3T3 -ĉeloj aŭ sinusoidaj endoteliaj ĉeloj) en 3D -medio, kie oni malhelpas rektan ĉelon - al - La komunikado inter la ĉeloj okazas per solveblaj citokinoj.

      Aplikoj:
      Uzita por studi ne - kontaktan komunikadon inter hepataj ĉeloj en la korpo.

      
      En resumo, Iphase, kiel gvidanto en in vitro -biologia esplorado, provizas ampleksajn solvojn por ne - klinika drogtestado. De la izolado kaj kulturo de primaraj hepatocitoj de diversaj specioj ĝis la disvolviĝo de subtenaj produktoj kiel kulturmedioj por specifaj aplikoj aŭ multi - specifa kolageno - tegitaj platoj, Ifase estas dediĉita al ofertado de la plej bonaj in vitro -esploraj iloj por malkovro de drogoj kaj disvolviĝo. Ni estas fidinda partnero por klientoj en la farmacia industrio, kompromitita provizi tranĉi - randajn solvojn por ne - klinika esplorado.