Fracción del hígado de rata inducido: un sistema de activación metabólica para las pruebas de genotoxicidad y mutación in vitro

Palabras clave: OCDE 471, OCDE 473, OCDE 476, OCDE 487, Prueba de mutación, genotoxicidad, toxicidad genética, hígado de rata inducido S9, prueba de Ames, prueba de mini ames, aberración cromosómica, micronucleos, ensayo de HPRT/HGPRT, asa de TK

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Introducción

Hígado de rata inducido S9es un componente clave para evaluar eltoxicidad genéticapotencial de productos químicos, especialmente en toxicología regulatoria. Se usa comúnmente en combinación con ensayos in vitro, como elPrueba de ames ypruebas de mutación, evaluar las propiedades mutagénicas de los compuestos. Al proporcionar un sistema enzimático rico en citocromo P450 (CYP450), la fracción del hígado de rata inducida S9 juega un papel crucial en la simulación de los procesos metabólicos que ocurren en el hígado, lo que ayuda a determinar si los productos químicos pueden causar mutaciones genéticas o cáncer.

Hígado de rata inducido S9

La fracción del hígado S9 se refiere a un sobrenadante post - Mitocondrial obtenido de homogeneizados de hígado de rata después de una serie de pasos de centrifugación. El término "inducido" se refiere al tratamiento de ratas con compuestos específicos que mejoran la actividad de las enzimas hepáticas, particularmente las enzimas citocromo P450 (CYP450), que son responsables del metabolismo de una amplia gama de xenobióticos.

La fracción del hígado de rata inducida S9 contiene una variedad de enzimas involucradas en el metabolismo de los productos químicos de fase I y fase II. Esto incluye enzimas como el citocromo P450 monooxigenasas, que facilitan la biotransformación oxidativa de los sustratos, imitando así el metabolismo del hígado humano.

Actividad de CYP450 y activación metabólica

La familia enzimática del citocromo P450 (CYP450) juega un papel fundamental en el metabolismo de una amplia variedad de sustancias, incluidos muchos productos farmacéuticos, productos químicos ambientales y carcinógenos. La fracción del hígado de rata inducida S9 contiene estas enzimas y es esencial para evaluar los productos químicos que solo pueden volverse genotóxicos después de la activación metabólica.

Muchos compuestos son inicialmente no tóxicos, pero pueden volverse tóxicos después del metabolismo en el hígado. Estos pro - mutágenos (que requieren que la activación metabólica se convierta en mutagénica) y pro - carcinógenos (que requieren activación para causar cáncer) solo pueden detectarse a través de ensayos que incluyen un sistema de activación metabólica S9. Sin la inducción de enzimas metabólicas como CYP450, estas sustancias pueden parecer inofensivas en las pruebas de genotoxicidad estándar.

Al agregar el hígado de rata inducido S9 a los ensayos in vitro, los investigadores pueden evaluar cómo una sustancia interactúa con las enzimas CYP450. Esto es particularmente importante para los productos farmacéuticos, ya que el metabolismo por las enzimas CYP450 es un paso crítico en la farmacocinética de muchos medicamentos.

Aplicaciones del hígado de rata inducido S9

1. 1. Prueba de Ames (OCDE 471)

La prueba de Ames, descrita en la guíaOCDE 471, es uno de los métodos más bien conocidos y ampliamente utilizados para evaluar la mutagenicidad. Implica exponer cepas de bacterias de Salmonella a un químico de prueba para ver si induce mutaciones que hacen que las bacterias vuelvan a un estado independiente de histidina.

Para simular el proceso metabólico humano, el hígado de rata inducido S9 a menudo se agrega al sistema de prueba. La fracción S9 proporciona las enzimas necesarias, incluida CYP450, que puede ser requerida para metabolizar el compuesto en una forma más reactiva que podría causar mutaciones en el ADN bacteriano. Esta combinación de S9 con la prueba AMES permite una evaluación más completa del potencial mutagénico al imitar mecanismos mutagénicos directos y activados metabólicamente.

2. 2.Pruebas de mutación (prueba de aberración cromosómica, prueba de micronúcleos y otros ensayos in vitro)

Además de la prueba de AMES, las pruebas de mutación se usan comúnmente para evaluar el potencial genotóxico de los productos químicos. Estas pruebas son más completas para evaluar un rango de daño genético, incluidas las mutaciones cromosómicas, las mutaciones génicas y la formación de micronúcleos. El hígado de rata inducido S9 se utiliza en las pruebas de mutación por las siguientes razones:

Prueba de micronúcleos (OCDE 487)

Esta prueba detecta la formación de micronúcleos en células, que son cuerpos pequeños y extraanucleares que contienen fragmentos de cromosomas o cromosomas enteros que no se han incorporado al núcleo durante la división celular. El prueba de micronúcleospuede detectar efectos clastogénicos (cromosomas - ruptura) y aneugénicos (que afectan el número de cromosomas). El hígado de rata inducido S9 se usa aquí para activar la sustancia de prueba metabólicamente, ya que algunos productos químicos solo causan daño cromosómico una vez que han sido metabolizadas por las enzimas hepáticas. La fracción S9 mejora la sensibilidad de la prueba al simular la activación metabólica que puede ocurrir in vivo.

Prueba de aberración cromosómica (OCDE 473)

Esta prueba evalúa si una sustancia puede causar daño estructural a los cromosomas al inducir descansos, deleciones, translocaciones u otros tipos de aberraciones. Como la prueba de micronúcleos, laprueba de aberración cromosómicase puede aplicar con o sin activación metabólica. El hígado de rata inducido S9 se agrega al sistema de prueba para imitar los procesos metabólicos en el hígado, lo que permite la evaluación de sustancias que podrían no causar daño cromosómico en su forma original, pero podrían hacerlo después del metabolismo del hígado.

Tabla 1. Consideraciones comparativas de las pruebas de mutación

Ensayo HPRT/HGPRT (OCDE 476)

En elEnsayo HPRT/HGPRT, los cultivos de las células de hámster chino (CHO o V79) o linfoblastoides humanos (TK6) están expuestos al químico de prueba en presencia de una mezcla metabólica del hígado de rata S9 inducido, que suministra enzimas CYP450 necesarias para convertir pro -mutones en especies reactivas de ADN. Después de un breve tratamiento y un período de expresión de siete días, las células se desafían con 6 -tioguanina; Solo los clones que llevan mutaciones de pérdida de función en el gen de fosforibosiltransferasa de hipoxantina -guanina sobreviven. Al comparar los recuentos de colonias mutantes con la viabilidad general, los investigadores determinan una frecuencia de mutación que, si se eleva reproduciblemente sobre los controles concurrentes e históricos, indica el potencial genotóxico.

Ensayos TK (OCDE 490 y OCDE 476)

ElEnsayo TK emplea células de linfoma de ratón L5178Y (OCDE 490) o células CHO (OCDE 476) Heterocigoto de ingeniería en el locus de timidina quinasa. Después de la mezcla de exposición química ± S9, las células se recuperan y se placan en medio que contiene trifluorotimidina, lo que mata a las células bien llamativas. Los mutantes sobrevivientes de TK⁻ forman colonias durante 10-14 días, con mutantes de colonias pequeñas que a menudo reflejan eventos cromosómicos y mutantes de gran colony que reflejan mutaciones puntuales. Al igual que en el ensayo HPRT/HGPRT, los controles de citotoxicidad estrictos y los puntos de referencia de mutagen positivos aseguran que los aumentos observados en la frecuencia de mutación reflejen de manera confiable el riesgo genotóxico de un compuesto.

4. 4. Evaluación del riesgo de cáncer

El hígado de rata inducido S9 también se usa en estudios destinados a evaluar el cáncer - causando el potencial de las sustancias. Al simular los procesos metabólicos que ocurren en el hígado humano, la fracción S9 puede ayudar a identificar compuestos que podrían conducir a la formación de metabolitos reactivos capaces de unirse al ADN y causar mutaciones que podrían conducir al cáncer.

Prueba de Ames mejorada con hígado hámster inducido S9

De acuerdo con las últimas pautas emitidas por la Agencia Europea de Medicamentos (EMA), la prueba tradicional de AMES puede no ser lo suficientemente sensible como para detectar el potencial mutagénico de ciertas impurezas n - nitrosamina, especialmente n - nitrosodimetilamina (NDMA), entre otras. Por lo tanto, la prueba AMES mejorada, desarrollada por el Centro Nacional de Investigación Toxicológica (NCTR), una división de la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA), se ha recomendado como una alternativa más confiable. La prueba de AMES mejorada introdujo la adición de hígado de hámster inducido S9, que se realizó en la contención del hígado de rata S9 del 30% y el 30% del hígado de hámster S9. Los sobrenadantes desmosomales de rata y hámster (S9S) deben prepararse a partir de hígados de roedores tratados con enzimas citocromo P450 - Sustancias inductoras. Al usar el hígado de hámster inducido S9, esta prueba mejorada simula mejor el metabolismo humano y aumenta la confiabilidad de los resultados.

Conclusión

El hígado de rata inducido S9 sirve como una herramienta crítica en las pruebas de genotoxicidad, ayudando a los investigadores y agencias reguladoras a evaluar el potencial mutagénico y cancerígeno de los productos químicos. Al proporcionar un sistema de activación metabólica, mejora la capacidad de ensayos como la prueba de AMES, las pruebas de mutación y los estudios de actividad de CYP450 para detectar sustancias que requieren la activación metabólica para convertirse en genotóxico. Sus aplicaciones son esenciales para garantizar la seguridad de nuevos medicamentos, productos químicos y productos de consumo. Con su papel en la simulación del metabolismo del hígado humano, la fracción del hígado de rata inducida S9 sigue siendo una parte indispensable de la toxicología moderna y las evaluaciones de seguridad regulatoria.