Indutseeritud roti maksa S9 fraktsioon: metaboolne aktiveerimissüsteem in vitro genotoksilisuse ja mutatsioonitestide jaoks

Märksõnad: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, mutatsioonitest, genotoksilisus, geneetiline toksilisus, indutseeritud roti maksa S9, AMES -test, mini Amesi test, kromosomaalne aberratsioon, mikronucleus, HPRT/HGPRT, TK ASPAY, TK ASGA

Ifaasitoode

Sissejuhatus

Indutseeritud roti maksa S9on põhikomponentgeneetiline toksilisusKemikaalide potentsiaal, eriti regulatiivses toksikoloogias. Seda kasutatakse tavaliselt koos in vitro testidega, näiteksAmesi test jamutatsioonitestid, ühendite mutageensete omaduste hindamiseks. Pakkudes tsütokroom P450 -ga rikkaid ensümaatilist süsteemi (CYP450), mängib indutseeritud roti maksa S9 fraktsioon olulist rolli maksas esinevate metaboolsete protsesside simuleerimisel, aidates kindlaks teha, kas kemikaalid võivad potentsiaalselt põhjustada geneetilisi mutatsioone või vähi.

Indutseeritud roti maksa S9

Maksa S9 fraktsioon viitab post -post - mitokondriaalsele supernatandile, mis on saadud roti maksa homogenaatidest pärast ridade tsentrifuugimise etappi. Mõiste "indutseeritud" viitab rottide töötlemisele spetsiifiliste ühenditega, mis suurendavad maksaensüümide, eriti tsütokroom P450 ensüümide (CYP450) aktiivsust, mis vastutavad paljude ksenobiootikumide metabolismi eest.

Indutseeritud roti maksa S9 fraktsioon sisaldab mitmesuguseid ensüüme, mis on seotud kemikaalide I ja II faasi metabolismis. See hõlmab selliseid ensüüme nagu tsütokroom P450 monooksügenaasid, mis hõlbustavad substraatide oksüdatiivset biotransformatsiooni, jäljendades sellega inimese maksa metabolismi.

CYP450 aktiivsus ja metaboolne aktiveerimine

Tsütokroom P450 ensüümiperekonnal (CYP450) mängib keskset rolli paljude ainete, sealhulgas paljude ravimite, keskkonnakemikaalide ja kantserogeenide metabolismis. Indutseeritud roti maksa S9 fraktsioon sisaldab neid ensüüme ja on hädavajalik kemikaalide hindamiseks, mis võivad genotoksiliseks muutuda alles pärast metaboolset aktiveerimist.

Paljud ühendid on algselt mitte - toksilised, kuid võivad pärast maksas metabolismi toksiliseks muutuda. Neid Pro - mutageenid (mis nõuavad metaboolset aktiveerimist mutageenseks) ja Pro - kantserogeenid (mis nõuavad vähktõve põhjustamiseks aktiveerimist) saab tuvastada ainult testide kaudu, mis hõlmavad S9 metaboolset aktiveerimissüsteemi. Ilma metaboolsete ensüümide nagu CYP450 indutseerimiseta võivad need ained standardse genotoksilisuse testides olla kahjutud.

Lisades indutseeritud roti maksa S9 in vitro testidele, saavad teadlased hinnata, kuidas aine interakteerub CYP450 ensüümidega. See on eriti oluline farmaatsiatoodete jaoks, kuna CYP450 ensüümide ainevahetus on paljude ravimite farmakokineetika kriitiline samm.

Indutseeritud roti maksa S9 rakendused

1. 1. AMES -test (OECD 471)

Amesi test, mis on kirjeldatud suunisOECD 471, on üks kõige hästi - tuntud ja laialdasemalt kasutatavaid meetodeid mutageensuse hindamiseks. See hõlmab Salmonella bakterite tüvede paljastamist testi kemikaalile, et näha, kas see kutsub esile mutatsioone, mis põhjustavad bakterite histridiini tagasipöördumist - sõltumatu olekusse.

Inimese metaboolse protsessi simuleerimiseks lisatakse katsesüsteemi sageli indutseeritud roti maksa S9. S9 fraktsioon annab vajalikud ensüümid, sealhulgas CYP450, mida võib vajada ühendi metaboliseerimiseks reaktiivsemaks vormiks, mis võib põhjustada bakteriaalse DNA mutatsioone. See S9 kombinatsioon AMES -testiga võimaldab mutageense potentsiaali põhjalikumat hinnata, jäljendades nii otseseid kui ka metaboolselt aktiveeritud mutageenseid mehhanisme.

2. 2.Mutatsioonitestid (kromosomaalse aberratsiooni test, mikrotuuma test ja muud in vitro testid)

Lisaks AMES -i testile kasutatakse kemikaalide genotoksilise potentsiaali hindamiseks tavaliselt mutatsioonitestid. Need testid on põhjalikumad geneetiliste kahjustuste, sealhulgas kromosomaalsete mutatsioonide, geenimutatsioonide ja mikrotuumade moodustumise hindamisel. Rottide indutseeritud maksa S9 kasutatakse mutatsioonikatsetes järgmistel põhjustel:

Mikrotuuma test (OECD 487)

See test tuvastab mikrotuumade moodustumise rakkudes, mis on väikesed ekstranukleaarsed kehad, mis sisaldavad kromosoomide või tervete kromosoomide fragmente, mida ei ole rakkude jagunemise ajal tuumasse lisatud. Selle mikrotuuma testOskab tuvastada klastogeenseid (kromosoom - purunemine) ja anegeenset (mõjutavat kromosoomi arvu) mõju. Testiaine metaboolseks aktiveerimiseks kasutatakse siin indutseeritud roti maksa S9, kuna mõned kemikaalid põhjustavad ainult kromosomaalseid kahjustusi, kui need on maksaensüümid metaboliseeritud. S9 fraktsioon suurendab testi tundlikkust, simuleerides in vivo toimuvat metaboolset aktiveerimist.

Kromosomaalne aberratsiooni test (OECD 473)

Selles testis hinnatakse, kas aine võib põhjustada kromosoomide struktuurilisi kahjustusi, indutseerides pause, deletsioonid, translokatsioonid või muud tüüpi aberratsioonid. Nagu mikrotuuma testkromosomaalne aberratsiooni testsaab rakendada metaboolse aktiveerimisega või ilma. Maksa metaboolsete protsesside jäljendamiseks lisatakse testsüsteemi indutseeritud roti maksa S9, võimaldades hinnata aineid, mis ei pruugi nende algsel kujul kromosomaalseid kahjustusi põhjustada, kuid võiks seda teha pärast maksa metabolismi.

Tabel 1. Mutatsioonitestide võrdlevad kaalutlused

HPRT/HGPRT test (OECD 476)

SisseHPRT/HGPRT test, Hiina hamstri (CHO või V79) või inimese lümfoblastoidrakkude (TK6) rakkude kultuurid puutuvad katsekemikaaliga kokku indutseeritud roti maksa S9 metaboolse segu juuresolekul, mis varustab CYP450 ensüüme, mis on vajalikud pro -mutageenide muutmiseks DNA -reaktiivseteks liikideks. Pärast lühikest ravi ja seitsmepäevast ekspressiooniperioodi vaidlustatakse rakud 6 -thioguaniiniga; Hüpoksantiin -guaniini fosforibosüültransferaasi geeni kadumisfunktsiooni mutatsioonid kannavad ainult kloonid. Võrreldes mutantsete kolooniate arvu üldise elujõulisusega, määravad teadlased mutatsioonisageduse, mis näitab reprodutseeritavalt nii samaaegse kui ka ajaloolise kontrolli korral genotoksilist potentsiaali.

TK testid (OECD 490 & OECD 476)

SelleTK test kasutab kas L5178Y hiire lümfoomirakke (OECD 490) või CHO rakke (OECD 476) Tümidiinkinaasi lookuses konstrueeritud heterosügootne. Pärast keemilist kokkupuudet ± S9 segu, taastuvad rakud ja on plaaditud trifluorotümidiini sisaldava söötmega, mis tapab TK -kasutusrakke. Ellujäänud tk⁻ -mutandid moodustavad kolooniad 10–14 päeva jooksul, väikese kolooniaga mutandid kajastavad sageli kromosomaalseid sündmusi ja suure värviga mutandid kajastavad punktmutatsioone. Nagu HPRT/HGPRT testis, tagavad ranged tsütotoksilisuse kontrollid ja positiivsed mutageeni võrdlusalused, et täheldatud mutatsioonisageduse suurenemine kajastavad usaldusväärselt ühendi genotoksilist riski.

4. 4. vähiriski hindamine

Indutseeritud roti maksa S9 kasutatakse ka vähi hindamiseks mõeldud uuringutes - Ainete potentsiaali põhjustamine. Inimese maksas toimuvate metaboolsete protsesside simuleerimisega võib S9 fraktsioon aidata tuvastada ühendeid, mis võivad viia reaktiivsete metaboliitide moodustumiseni, mis on võimelised seonduma DNA -ga ja põhjustab mutatsioone, mis võivad põhjustada vähki.

Täiustatud AMES -test indutseeritud hamstri maksa S9 -ga

Euroopa Ravimite agentuuri (EMA) väljaantud viimaste suuniste kohaselt ei pruugi traditsiooniline AMES -i test olla piisavalt tundlik, et tuvastada teatud N - nitrosamiini lisandite, eriti N - nitrosodimetüülamiini (NDMA) mutageenset potentsiaali. Seetõttu on usaldusväärsema alternatiivina soovitatud täiustatud AMES -testi, mille on välja töötanud USA toidu- ja ravimiameti osakonna (NCTR), mis on USA toidu- ja ravimiameti osakond (NCTR). Täiustatud AMES -test tutvustas indutseeritud hamstri maksa S9 lisamist, mis sisaldas 30% roti maksa S9 ja 30% hamstri maksa S9. Rotti ja hamsteri desmosomaalsed supernatandid (S9S) tuleks valmistada näriliste maksadest, mida töödeldi tsütokroom P450 ensüümiga - indutseerivad ained. Kasutades indutseeritud hamstri maksa S9, simuleerib see täiustatud test paremini inimese ainevahetust ja suurendab tulemuste usaldusväärsust.

Järeldus

Indutseeritud roti maksa S9 on kriitiline vahend genotoksilisuse testimisel, aidates teadlastel ja reguleerivatel agentuuridel hinnata kemikaalide mutageenset ja kantserogeenset potentsiaali. Metaboolse aktiveerimissüsteemi pakkumisega suurendab see testide võimet nagu AMES -test, mutatsioonitestid ja CYP450 aktiivsusuuringud ainete tuvastamiseks, mis vajavad metaboolset aktiveerimist genotoksiliseks. Selle rakendused on olulised uute ravimite, kemikaalide ja tarbekaupade ohutuse tagamiseks. Selle rolliga inimese maksa metabolismi simuleerimisel on indutseeritud roti maksa S9 fraktsioon jätkuvalt tänapäevase toksikoloogia ja regulatiivse ohutuse hindamise asendamatu osa.