Esmased hepatotsüüdid: ülioluline vahend mittekliiniliste in vitro ravimite edendamiseks

Esmased hepatotsüüdid: ülioluline vahend mittekliiniliste in vitro ravimite edendamiseks

Maksana on ravimiga kokkupuute peamine organ, mis on oluline roll ravimite metabolismi ja toksilisuse protsessides. Primaarsetel hepatotsüütidel on ensüümide ja kofaktorite, sealhulgas membraan - köidetud ensüümide, näiteks tsütokroom P450 (segatud - funktsiooni oksüdaasi sileda endoplastilise retikulumi), ja tsütosoolse retikulumi, ja tsütosoolse esteraaside, kõigi metaboolsete radade, ensom -ensüümide, sealhulgas membraanide füsioloogiliste tasemete täielik spekter, mis hõlmavad kõiki metaboolseid rada. Sel põhjusel peetakse primaarseid hepatotsüüte laialdaselt maksamudelite konstrueerimise kuldstandardiks ning neid eelistavad teadlased ravimite koostoime, ravimite metabolismi ja toksilisuse uuringute alal. See artikkel annab ülevaate 2D- ja 3D -kultuurimudelitest, mis põhinevad primaarsetel hepatotsüütidel ja nende rakendustel ravimite väljatöötamisel.

Märksõnad: primaarsed hepatotsüüdid, 2D kasvatamine, 3D kasvatamine, organoidid, CO - kultuur.

1. 1. primaarsete hepatotsüütide eraldamine

Primaarsete hepatotsüütide eraldamine on kriitiline samm maksamudelite in vitro mudelite loomisel, kõige sagedamini kasutatav on kaks - astme kollagenaasi perfusioonimeetodit. Väiksematel loomadel saab maksa perfusiooni läbi viia portaalveeni või madalama vena cava kaudu, suuremad loomad vajavad tavaliselt perfusiooni maksa lobede või segmentide kaudu. Hepatotsüütide edukat eraldamist mõjutavad mitmed peamised tegurid: esiteks peaks kollagenaas olema mitte - tsütotoksiline. Teiseks on seedimise ajastus ülioluline -Nii seedimise kui ka üle - Seedimine võib kahjustada hepatotsüütide saaki ja elujõulisust. Kolmandaks peab maksa seisund olema optimaalne, kuna hepatotsüüdid on isheemiliste kahjustuste suhtes väga tundlikud. Hepatotsüütide valmistamiseks kasutatav maks tuleks kiiresti jahutada, et vähendada metaboolseid kiirusi ja vältida metaboolset hüpoksiat ja sellele järgnevat isheemiat.

Narkootikumide uurimisel kasutatud primaarsete hepatotsüütide standardid on järgmised:

1. 2. primaarne hepatotsüütide 2D kultuur

Vedrustuse hepatotsüütide mudel

See sisaldab täielikku ravimit - metaboliseerivad ensüümid ja kofaktorid, muutes selle sobivaks erinevate metaboolse kliirensi radade uurimiseks. Vedrustuse hepatotsüütide elujõulisus ja ravimi aktiivsus - metaboliseerivad ensüümid vähenevad järk -järgult inkubatsiooni aja suurenedes, piirates inkubatsiooniaega maksimaalselt 4 tunnini. Seda mudelit kasutatakse tavaliselt mõõduka kuni kõrge kliirensi määraga ravimite kliirensi hindamiseks. Kui kliirensi määr on väiksem kui 20%, ei saa täpseid kliirensi väärtusi kindlaks teha. Traditsiooniline suspensiooni hepatotsüüt - põhinevad in vitro metabolismi mudelid ei ole ebapiisavad aeglaste metaboolsete metaboolsete metaboolsete reaktsioonide genereerimiseks - metaboliseerivad ühendid, piirates nende võimet ennustada nende ühendite kliirensit ja metaboolseid tooteid. Vedrustuse hepatotsüütide relee meetodit (joonis 1) saab kasutada inkubatsiooniaja pikendamiseks 20 tunnini või isegi kauem.

Rakendus:Ensüümi aktiivsus ja metaboolsed stabiilsusuuringud väikeste molekulide ravimite jaoks.

Joonis 1. Vedrustuse hepatotsüütide relee meetodi ülekandeprotsess

Allikas: narkootikumide metabis, 2012,40 (9): 1860–1865

Plaaditava hepatotsüütide mudel

Esmaseid hepatotsüüte kultiveeritakse kollageeniga kaetud kultuuriplaatidel 2D -süsteemis. Hepatotsüütidel on epiteeli morfoloogia, millel on väljaulatuvad tuumad, sageli esinevad binukleatiga kujul. Üksiku hepatotsüütide ühekihilise kultuuri puudused hõlmavad: 1. Rakkude polaarsuse ja funktsiooni muutmine.2. Muude asjakohaste rakutüüpide (st mitte - parenhüümirakkude) puudumine, mis on vajalikud normaalseks funktsioonile.3. Suutmatus pakkuda piisavaid toitaineid ja parakriinitegureid hepatotsüütide toetamiseks nende funktsioonide täitmisel (näiteks sapphape ja seerumi valgu biosünteesi).

Rakendused:

1). Ravimi hindamine - ravimite koostoimed:See hõlmab ensüümide induktsiooni, ensüümide pärssimist ja transporteri uuringuid. Esiteks, kui ravim toimib indutseerijana, võib see põhjustada ravimi suurenenud ekspressiooni - metaboliseerivad ensüümid ja transporterid. Tugevad indutseerijad saavad samaaegselt mitut geeni ülesreguleerida, näiteks CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT fenobarbitaalse indutseerimine ja mitmed transpordivalgud, näiteks MRP2. Teiseks on liike - spetsiifilised erinevused, kuidas hepatotsüüdid indutseerijatele reageerivad. Näiteks on rifampitsiin tõhus indutseerija inimese ja küüliku hepatotsüütidele, kuid sellel puudub roti hepatotsüütidele induktsioon. Lõpuks võib lavastatavate hepatotsüütide suboptimaalne plaadistustihedus põhjustada p450 -de basaalse ekspressiooni vähenemist ja kunstlikult suurenenud induktsioonireaktsioone. Nagu on näidatud joonisel 3, näitavad madalama plaadistustihedusega hepatotsüütidel CYP1A2, CYP2B6 ja CYP3A4 madalamat baasi aktiivsust, kuid tugevamad induktsioonireaktsioonid. Seetõttu on füsioloogiliselt asjakohaste andmete saamiseks vajalikud tervislikud hepatotsüüdid sobiva plaadistamise tihedusega.

Joonis 2

Allikas: praegused ravimite avastamise tehnoloogiad, 2010, 7: 188 - 198 - 198

2). Hepatotoksilisuse hindamine: Morfoloogiliste muutuste jälgimine valguse mikroskoobi all, näiteks rakkude morfoloogia, vaakum- ja lipiidide tilkade agregatsioon ning rakkude kinnitus/eraldamine. Hepatotsüütide nekroosi (mida näitab aspartaat aminotransferaasi, laktaatdehüdrogenaasi ja alaniini aminotransferaasi) ja apoptoosi tuvastamine. Tsütokiini - vahendatud tsütotoksilisuse korral ei suuda hepatotsüütide üksikkihilised kultuurid ennustada toksilisi vastuseid, mis on tingitud naabruses asuvatest mitte - parenhüümirakkudest vabastatud ainete reguleerimisest, näiteks Kupfferi rakud, stellaatrakud ja sinusoidsed endoteelirakud.

3). "Relee meetod" aeglase metaboliseeriva ühendi kliirensi ja selle metaboliitide uurimiseks: Ravimi aktiivsus - metaboliseerivad ensüümid plaaditavates hepatotsüütides hakkab vähenema pärast 24 -tunnist plaatimist. Pärast inkubeerimist lammutatavate hepatotsüütide seerumiga - Vaba sööde, mis sisaldab huvipakkuvat ühendit 24 tundi, kogutakse ja segatakse keskkond, seejärel kantakse edasiseks uurimiseks uutesse plaatitavatesse hepatotsüütidesse (joonis 3).

Joonis 3. Pahata hepatotsüütide relee meetodi ülekandeprotsess

Allikas: ravimite metabolismi kirjad, 2016, 10: 3 - 15

3). Hinnake raku omastamist, endotsütoosi, endosomaalset põgenemist ja vaigistavat mõju hepatotsüütide sihtgeenile - sihiti väikeseid nukleiinhapperavimeid.

Võileiva kultiveerimise mudel

In vitro saab hepatotsüüte kultiveerida kahe kihi kollageeni või matrigeli vahel, et rekonstrueerida in vivo struktuure, mida nimetatakse võileiva kasvatamiseks. Kahe geeli kihi (võileiva struktuur) kultiveeritud hepatotsüüdid võivad parandada rakkude morfoloogiat ja elujõulisust ning säilitada nende funktsionaalsust pikemaks ajaks. Lisaks võivad võileivakultuuris olevad hepatotsüüdid taastada polaarsuse, võimaldades basolateraalsete ja kanalite transportijate nõuetekohast lokaliseerimist, samuti funktsionaalsete sapijuhade võrkude moodustumist (joonis 4).

Joonis 4. Transporterite polariseeritud ekspressioon inimese hepatotsüütide võileivamudelis

Allikas: praegused ravimite avastamise tehnoloogiad, 2010, 7, 188 - 198 -

Rakendused:

1. 1). Ühendite sapiteede eritumise hindamine.
2. 2). Endogeensete ja eksogeensete ühendite ja metaboliitide maksa ja sapiteede jaotuse hindamine.
3. 3). Metabolismi ja transportijate vahendatud kliirensi hindamine ning füsioloogia konstrueerimine - põhinevad farmakokineetilised mudelid.
4. 4). Hepatotoksilisuse uurimine ja kliinilise ravimi mehhanismide pakkumine - põhjustatud maksakahjustus. Andmed integreeritakse süsteemide farmakoloogiamudelitesse, et ennustada võimalikku ravimit - Inimestel põhjustatud maksakahjustus.
5.  
   1. 3. primaarne hepatotsüütide 3D -kultuur

6. 3D -kultuurisüsteemides kultiveeritakse hepatotsüüte kolmes - mõõtmete maatriksis, mis jäljendab paremini in vivo maksaarhitektuuri võrreldes 2D ühekihiliste kultuuridega. Need süsteemid soodustavad rakkude ja raku - maatriksi interaktsioone, mis võivad taastada rohkem maksa füsioloogilisi funktsioone, sealhulgas ravimite metabolismi, valkude sekretsiooni ja sapi moodustumist. Primaarseid hepatotsüütide 3D -kultuure saab kasutada maksa uurimiseks - Spetsiifilised funktsioonid in vivo - nagu keskkond, pakkudes eeliseid ravimite testimiseks, toksilisuse hindamiseks ja haiguste modelleerimiseks.

   Sfäärimudel

Selliste tehnikate kaudu nagu ultra - Madal kinnituskultuur, rippuva tilgakultuur ja magnetilise rakukultuur (joonis 5), võivad primaarsed hepatotsüüdid agregeeruda sfäärilisteks agregaatideks, mille läbimõõt on kuni 150 - 175 um, ilma et välisetele maatriksitele tugineda. Sferoidkultuuri üks eelis on see, et iga sferoid nõuab ainult 1330 - 2000 rakku, vähendades märkimisväärselt rakkude arvu võrreldes teiste 3D -kultuuri tehnikatega. Värsked uuringud on näidanud, et primaarsed hepatotsüütide sfäärilised kultuurid võivad säilitada kuni 5 nädalat. CYP ensüümide aktiivsus jääb 8. ja 35. päeva vahel peaaegu muutumatuks. Proteoomika analüüs näitas, et võrreldes võileivakultuuriga on ensüümid, mis vastutavad ravimite imendumise, metabolismi ja eritumise eest, paremini säilinud 14 -päevase kultuuri jaoks. Kuid maks on palju keerulisem kui raku agregaat. Hepatotsüütide basolateraalne külg interakteerub verega, sapp aga voolab apikaalsest küljest välja, mis on keeruka maksa lobula struktuuri võtmeomadus, ja seda ei saa veel sfäärimudelis korrata.

Rakendused:

1. 1). Aeglase metaboliseeriva ühendi kliirensi ja selle metaboliitide uurimine.
2. 2). Hepatotoksilisuse uurimine.
3. 3). Rakkude omastamise, endotsütoosi, endosomaalse põgenemise ja hepatotsüütide sihtgeenide vaigistamise mõju hindamine - sihitud väikesed nukleiinhapperavimid.

Joonis 5. Sfääroidkultuuri meetod

Maksa organoidide mudel

Organoidide konsensuse määratlus on järgmine: tüvirakkudest, eellasrakkudest või diferentseeritud rakkudest saadud 3D -struktuurid, mis on võimelised reprodutseerima loodusliku koe teatavaid funktsioone ja struktuure in vitro, jäljendades tõhusalt in vivo mikrokeskkonda ja raku - kuni - rakkude interaktsioonid. Maksaorgaanid on määratletud inimese maksa bioloogiauuringute kõige arenenumaks mudeliks.

Rakuallikad maksa organoidse konstruktsiooni jaoks:

① Pluripotentsed tüvirakud (PSC):

Embrüonaalsete tüvirakkude (ESC) ja indutseeritud pluripotentsete tüvirakkude (IPSC) omavad suurt pluripotentsust, plastilisust ja piiramatut proliferatiivset võimekust. Spetsiifiliste signaalimistegurite mõjul eristuvad need hepatotsüütideks - nagu aktiivsuse ja funktsiooniga rakud. Kuid PSC -st saadud maksaorganoidid võivad läbi viia epigeneetilised ja geneetilised muutused, millel on amplifikatsiooni ajal kromosomaalsed aneuploidsed muutused.

Rakendused:

1. 1). Geneetilise maksahaiguse mudelid
2. 2). Nakkuslikud maksahaiguse mudelid
3. 3). Ravimite tsütotoksilisuse testimine

② Maksakude - tuletatud rakud: nende hulka kuuluvad kolangiotsüüdid ja hepatotsüüdid. Küpsed hepatotsüüdid säilitavad tüvirakkude potentsiaali ja proliferatiivse võimekuse konkreetses keskkonnas. Võrreldes PSC - saadud organoididega on primaarkoest saadud organoidid küpsemad, stabiilsemate genoomidega ning säilitavad fenotüüpse ja geneetilise stabiilsuse pika - termini in vitro kultuuri ajal. Kuid küpsete hepatotsüütide organoidide pikk - termin proliferatiivne võime võrreldes inimese loote hepatotsüütidega või täiskasvanud hiire primaarsed hepatotsüütidega. Täiskasvanud hepatotsüütide organoidide kultiveerimine on endiselt keeruline.

Kultuurimeetod (joonis 6): Maksakude lagundatakse üksikuteks rakkudeks ning matrigeli ja rakkude segu külvatakse 24 - kaevu plaadil, moodustades kupli - kujulised struktuurid. Inkubeerige rakukultuuri inkubaatoris (37 ° C) 15 minutit. Pärast tahkumist lisage konkreetne sööde. Läbipääs umbes 14 päeva pärast. Asendage algne sööde diferentseerimiskeskkonnaga pärast 7 - 10 päeva.

Rakendused:

1. 1). Hepatotoksilisuse mudelid
2. 2). In vitro metabolismi häirete uuringud
3. 3). Mitte - alkohoolne rasvane maksahaigus
4. 4). Ravimite väljatöötamine healoomuliste ja pahaloomuliste maksahaiguste jaoks

Joonis 6

Allikas: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

Sfäärikultuuri ja organoidkultuuri võrdlus

4. primaarne hepatotsüüt CO - Kultuurimudel

1. 1. 2D primaarne hepatotsüüt CO - Kultuurimudel
      

      2D primaarses hepatotsüütide CO - Kultuurimudelis segatakse ja kultiveeritakse kaks või enamat tüüpi rakutüüpi kahes - mõõtmelises keskkonnas. Selle mudeli põhijooneks on otsene interaktsioon erinevate rakutüüpide, rakkude ja rakuvälise maatriksi vastastikmõju või kaudse signaali ülekande tsütokiinide ja keemilise side kaudu. Esmaseid hepatotsüütide funktsioone, näiteks albumiini tootmise ja ravimite metabolismi võime, saab säilitada kuni kolm nädalat.

      Rakendused:

      1. 1). Primaarsed hepatotsüüdid CO - Kultiveeritud fibroblastidega: seda mudelit kasutatakse aeglase - metaboliseerivate ühendite ja nende metaboliitide kliirensi määramiseks.
      2. 2). Primaarsed hepatotsüüdid Co - kultiveeritud mitte - parenhüümiliste maksarakkudega (nt stellaatrakud, sinusoidsed endoteelirakud): see mudel on kasulik ravimi indutseeritud maksakahjustuse (DILI) uurimiseks, kuna see aitab uurida tsütokiinide, kemokiinide ja kasvufaktorite rolli maksavastutuse pärast ravijärgselt.
      3. 3). Primaarsed hepatotsüüdid CO - kultiveeritud T -rakkudega: seda mudelit kasutatakse maksa ravimi metabolismi tuvastamiseks - Spetsiifilised T -rakkude vastused.
      4. 4). Ifaasi Hepatomax ™CO - Kultuurisüsteem: ifaas on välja töötanud erinevate liikide primaarsete hepatotsüütidega kultuurisüsteemi, mida tuntakse hepatomaxina™. CO - Inimese primaarsete hepatotsüütide kultiveerides stroomarakkudega on võimalik säilitada head ravimit - Ensüümide aktiivsuse metaboliseerimine inimese hepatotsüütides kuni 3 nädalat. See süsteem sobib aeglaseks uurimiseks - Metaboliseerivad ühendkruusid ja nende metaboliite.

      See CO - kultuurimudel pakub füsioloogilisemat platvormi ravimite metabolismi, toksilisuse ja maksa hindamiseks - Seotud haiguse protsessid, pakkudes teavet selle kohta, kuidas erinevad rakutüübid maksavad maksafunktsiooni ja haigusi.
      
      

      3D primaarne hepatotsüüt CO - Kultuurimudel

      Otsene 3D Co - Kultuur: See mudel hõlmab kahe või enama erinevat tüüpi maksarakkude (nt primaarseid hepatotsüüte, sinusoidseid endoteelirakke, maksa stellaatrakke, kupfferi rakke), et moodustada ise - kokku pandud sfäärid või Co - kultiveerida neid 3D -keskkonnas, mis on konstrueeritud sellistesse materjalidesse nagu kollageen, fibriin, algmine või hüdrogeels. Otsene 3D CO - Kultuur võimaldab tihedat interaktsiooni erinevate maksarakkude vahel selliste mehhanismide kaudu nagu rakk - kuni rakkude adhesioon, parakriini signaalimine lahustuvate tsütokiinide kaudu ja rakuvälise maatriksi adhesiooni kaudu, mis võimaldab sidet hepatotsüütide vahel.

      Rakendused:

      1. 1). Maksafibroosi mudel: kasutatakse maksafibroosi mehhanismide ja progresseerumise uurimiseks.
      2. 2). Ravim - indutseeritud maksakahjustuse (DILI) mudel: aitab simuleerida ja hinnata ravimite põhjustatud maksakahjustusi.
      3. 3). Ravimite koostoimed, ravimite metabolism ja ensüümide induktsioon: hinnatakse, kuidas erinevad ravimid interakteeruvad, kuidas neid metaboliseerub ja kuidas nad indutseerivad maksaensüüme.

      Kaudne 3D CO - Kultuur: See meetod kasutab füüsikalist eraldussüsteemi (nt Transwelli või muid materjale), et kultuuris kahe või enama raku (näiteks primaarsed hepatotsüüdid NIH/3T3 rakkudega või sinusoidaalsete endoteelirakkudega) kultuuris 3D -keskkonnas, kus otsene rakk - kuni raku kontakti on takistatud. Rakkude vaheline suhtlus toimub lahustuvate tsütokiinide kaudu.

      Rakendused:
      Kasutatakse mitte - Non - kontaktside keharakkude vahel kehas.

      
      Kokkuvõtlikult pakub ifaas in vitro bioloogiliste uuringute liidrina põhjalikke lahendusi mittekliiniliste ravimite testimiseks. Alates primaarsete hepatotsüütide eraldatusest ja kultuurist erinevatest liikidest kuni toetavate toodete, näiteks kultuurimeedia väljatöötamiseni konkreetsete rakenduste jaoks või multi - Spetsifikatsioonikollageen - Ka kaetud plaadid, on ifaas pühendunud parimate in vitro uurimisvahendite pakkumisele ravimite avastamiseks ja arendamiseks. Oleme farmaatsiatööstuse klientide usaldusväärne partner, kes on pühendunud mittekliiniliste uuringute jaoks Cutting - Edge Solutions.