Hepatocyte primarioak: droga-ikerketa klinikoa ez -

Hepatocyte primarioak: droga-ikerketa klinikoa ez -

Gibelak, drogen esposizioaren organo nagusiak funtsezko eginkizuna du droga metabolismoan eta toxikotasun prozesuetan. Hepatokito primarioek entzimak eta kotafektoreen ezaugarri eta maila fisiologikoen espektro osoa dute. Hori dela eta, hepatozito primarioak asko dira Vitro gibeleko ereduak eraikitzeko urrezko estandar gisa eta drogen arteko interakzioan, drogen metabolismoaren eta toxikotasun azterketetarako ikertzaileek mesede egiten dute. Artikulu honetan hepatozito primarioetan eta drogen garapenean dituzten aplikazioen oinarritutako 2D eta 3D kulturaren eredu orokorra eskaintzen da.

Keywords: Hepatocyte primarioak, 2D laborantza, 3D laborantza, organoak, co - Kultura.

1. 1. Hepatokito primarioen isolamendua

Hepatocyte primarioen isolamendua urrats kritikoa da in vitro gibeleko ereduak ezartzeko, bi urratseko kolagenasa perfusio metodoa gehien erabiltzen dena. Animalia txikiagoetan, gibeleko perfusioa atariaren zainaren edo beheko vena cava bidez egin daiteke, eta animalia handiagoek normalean perfusioa eskatzen dute gibeleko lobuluen edo segmentuen bidez. Hainbat faktorek hepatozitoen isolamendu arrakastatsuan eragina dute: Lehenik eta behin, kolagenase ez da zitotoxikoa izan behar. Bigarrena, digestioaren denbora funtsezkoa daBiak - digestioa eta gainetik - digestioak hepatozitoen errendimendua eta bideragarritasuna arriskuan jar ditzake. Hirugarrena, gibeleko egoerak ezin hobea izan behar du, hepatozitoak kalte iskemikoekiko sentikorrak direnez. Hepatokitoen prestaketarako erabiltzen den gibela azkar hoztu behar da tarifa metabolikoak murrizteko eta hipoxia metabolikoa eta ondorengo iskemia ekiditeko.

Honako hauek dira droga ikerketan erabiltzen diren hepatozito nagusien estandarrak:

1. 2. Hepatocyte 2D Kultura

Esekidura Hepatocyte eredua

Droga osoa dauka - entzimak eta kofaktoreak metabolizatzea, hau da, hainbat argiztapen metaboliko bide aztertzeko egokia da. Hala ere, etetearen hepatozitoen bideragarritasuna eta drogen jarduera - Entzimak metabolizatzea pixkanaka gutxitzen da in vitro inkubazio denbora handitzen doan heinean, inkubazio denbora gehienez 4 orduz mugatuz. Eredu hau normalean drogak drogen garbiketa tasa moderatuetara murrizteko erabiltzen da. Garbiketa-tasa% 20 baino txikiagoa denean, ezin da zehaztu baimen zehatzak. Esekidura tradizionalaren hepatokitoa - In vitro metabolismoaren ereduak ez dira nahikoa konposatu metabolizatzeko erreakzio metaboliko detektagarriak sortzeko, eta, beraz, konposatu horien garbiketa-tasak eta produktu metabolikoak aurreikusteko gaitasuna mugatzen dute. Esekidura hepatozitoaren errelebo metodoa (1. irudia) inkubazio denbora 20 ordu edo gehiago luzatzeko erabil daiteke.

Aplikazioa:Entzima jarduera eta material metabolikoen ikasketak molekula txikientzako droga txikientzat.

1. irudia. Esekidura Hepatocyte errele metodoa transferitzeko prozesua

Iturria: Drug Metab Dispos, 2012,40 (9): 1860-1865

Hepatokitoen eredua

Hepatokito primarioak 2D sistema batean kulturatzen dira Collagen - estalitako kulturaren plakak. Hepatokitoek morfologia epitelial bat erakusten dute, nukleo irtetenarekin, askotan binukleatutako forma batean aurkezten. Hepatocyte Monolayer kultura bakarraren eragozpenak honakoak dira: 1. Zelula polaritatea eta funtzioa aldatzea.2. Funtzio normala lortzeko beharrezkoak diren beste gelaxka mota ez falta (I.e., ez - parenchymal). Hepatozitoak egiteko mantenugai eta paracrine faktore nahikoak izateko ezintasuna, hepatozitoak beren funtzioak antzezteko (hala nola, Bile Azidoa eta Serum proteina biosintesia).

Aplikazioak:

1). Drogaren ebaluazioa - Droga interakzioak:Entzima indukzioa, entzima inhibizioa eta garraiatzaile ikasketak barne hartzen ditu. Lehenik eta behin, droga batek induzitzaile gisa jokatzen duenean, drogen adierazpen handiagoa ekar dezake enzimak eta garraiatzaileak metabolizatzea. Inducers indartsuek gene ugari aldi berean altxatu ditzakete, hala nola Cyp2b6, CYP3A4, CYP2C9, UGT eta MRP2 bezalako hainbat garraio proteina. Bigarrenik, espezieak - hepatokitoek induzitzaileei erantzuten dien desberdintasun espezifikoak. Adibidez, Rifampicin hepatozitoen giza eta untxia lortzeko induzitzaile eraginkorra da, baina ez du inolako eraginik arratoien hepatokitoetan. Azkenean, hepatozitoen plaka azpimultzoen dentsitateak P450S-en adierazpen basala eta artifizialki handitutako indukzio erantzunak sor ditzake. 3. irudian, hepatozitoek plaka baxuagoko dentsitateetan erakusten dute Cyp1a2, CYP2B6 eta CYP3A4 jarduera basal txikiagoa, baina indukzio erantzun sendoagoak. Hori dela eta, hepatozito osasuntsuak plaka-dentsitate egoki batean beharrezkoak dira fisiologikoki datu garrantzitsuak lortzeko.

2. irudia. Kriopreservatutako giza hepatozitoen eta entzimaren indukzioaren arteko plaka-dentsitatearen arteko erlazioa

Iturria: Drogaren aurkikuntza teknologiak, 2010, 7: 188 - 198

2). Hepatotoxikotasunaren ebaluazioa: Aldaketa morfologikoak behatuz mikroskopio arin baten azpian, hala nola, zelulen morfologia, hutsean eta lipidoen tantazko agregazioa eta zelulen eranskina / urruntzea. Hepatocyte nekrosia hautematea (Aspartate aminotransferase, laktato deshidrogenasa eta Alanine AminoTransFerase) eta APOPTOSIS (DNAko zatiketa) adierazten dute. CytotoxIty - Hepatoxikotasun bakarreko cytotoxikotasuna, ezin da erantzun toxikoak aurreikusi auzoko ez diren zelulak ez direnez, esaterako, zelula zelulak, zelulak eta zelula endotelial sinusoidalak.

3). "Erlazio metodoa" konposatu konposatu motela eta haren metabolitoak aztertzeko: Drogaren jarduera - Entzimak metabolizatzea hepatozitoetan sartzen da 24 orduko xaflaren ondoren. Hepatozitoak sartu ondoren, serumarekin, doako ertaina 24 orduz interes konposatua duen doakoa da, euskarria biltzen eta nahastu da, eta ondoren hepatozito berrietara transferitu da azterketa gehiago egiteko (3. irudia).

3. irudia. Pactoable hepatocyte errele metodo transferentzia prozesua

Iturria: Droga metabolismoaren gutunak, 2016, 10: 3 - 15

3). Ebaluatu zelularen uptake, endokitosia, ihesa endosomikoa eta hepatokitoen xede genearen gaineko efektuak - azido nukleiko txikiak zuzenduta.

Sandwich laborantza eredua

In vitro, hepatozitoak bi kolageno edo matragel geruza artean kulturatu daitezke, ogitartekoa laborantza gisa ezagutzen direnak. Bi gelen artean kokatutako hepatozitoek - Kolagenoek (sandwich egitura) zelulen morfologia eta bideragarritasuna hobetu ditzakete eta funtzionaltasuna mantentzen dute epe luzeago batez. Gainera, ogitarteko kulturan hepatozitoak polaritatea berreskuratu ahal izango dute, basolateral eta kanalikular garraiatzaile egokiak behar bezala kokatzea ahalbidetuz, baita behazun hodien sare funtzionalen eraketa ere (4. irudia).

4. irudia. Humatocyte ogitarteko ereduan garraiatzaileen adierazpen polarizatua

Iturria: Uneko Drogak Discovery Technologies, 2010, 7, 188 - 198

Aplikazioak:

1. 1). Konposatuen excretio biliarra kalkulatzea.
2. 2). Konposatu endogeno eta exogenoen banaketa hepatikoa eta biliarra ebaluatzea.
3. 3). Metabolismoaren eta garraiatzaileek bitartekatutako eta fisiologia eraikitzea eta farmakokinetiko ereduak eraikitzea.
4. 4). Hepatotoxikotasuna aztertzea eta droga klinikoetarako mekanismoak eskaintzea - gibeleko lesioa eraginda. Datuak sisteman farmakologiako modeloetan integratzen dira, droga potentziala aurreikusteko - gibeleko lesioa gizakiengan.
5.  
   1. 3. HEPATOCYTE 3D KULTURA

6. 3D Kultur Sisteman, hepatozitoak hiru dimentsiotako matrizeetan kulturatzen dira, Vivo gibeleko arkitekturan imitatzen dutenak, 2D Monolayer kulturekin alderatuta. Sistema horiek zelula - Zelula eta gelaxka - Matrizearen interakzioak sustatzen dituzte, gibeleko funtzio fisiologikoak gehiago berreskuratu ditzaketenak, drogen metabolismoa, proteina sekrezioa eta behazunketa barne. Hepatokito primarioa 3D kulturak gibelean ikasteko erabil daitezke: funtzio zehatzak Vivo-n baino gehiagotan - Ingurumena bezala, drogak probatzeko, toxikotasun ebaluaziorako eta gaixotasunen modelizaziorako abantailak eskainiz.

   Esferoide eredua

Ultra - eranskin txikiko kultura, beherakada txikiko kultura eta zelula magnetikoaren kultura (5. irudia), hepatozito primarioak 150 - 175 μm-ko diametroa duten agregatu esferoidaletan agregatu dezake kanpoko matrizetan oinarritu gabe. Esferoideen kulturaren abantaila bat da esferoide bakoitzak 1.330 - 2.000 zelula baino ez dituela, zelula kopurua nabarmen murriztuz, 3D kulturako beste tekniken aldean. Azken ikerketek hepatozitoen esferaren berriek 5 astez iraun dezakete, CYP entzimaren jardueraren arabera, 35. egunaren artean ia aldatu gabe dagoela. Hala ere, gibela zelula agregatua baino askoz ere konplexuagoa da. Hepatozitoen alde basolateralak odolarekin elkarreragiten du, eta behazunak alde apikaletik isurtzen dira, eta hori da gibeleko lobuluen egitura konplexuaren funtsezko ezaugarria, eta hori ezin da oraindik erreplikatu esferoide ereduan.

Aplikazioak:

1. 1). Konposatu konposatu motela eta bere metabolitoak aztertzea.
2. 2). Hepatotoxikotasun ikerketa.
3. 3). Ebaluazioa, endozitosia, ihesa endosomikoa eta hepatokitoaren xede geneak eta isurketa efektuak - azido nukleiko txikiak zuzenduta.

5. irudia. Spheroid kulturaren metodoa

Gibeleko organoak eredua

Organoideen adostasunaren definizioa hauxe da: zelula amak, progenitor zeluletatik edo zelula desberdinetan eratorritako 3D egiturak, bertako ehunen ehuneko funtzio eta egitura batzuk erreproduzitzeko gai direnak, mikroibilizazioan eta zeluletan mimetikoki mimika egitea - To - Zelulen elkarrekintzak. Gibeleko organoak giza gibeleko biologiaren ikerketarako eredu aurreratuena izan da.

Gibeleko organoa eraikitzeko zelulen iturriak:

① Zelula amak (PSCak):

Enbrioiaren zelulen enbrioiak (ESCS) eta eragindako zelula amak (IPSCak) pluripotentzia, plastikotasuna eta ugaritasun handiko gaitasuna dute. Seinaleztapen faktore espezifikoen eraginpean, hepatokitoetan bereizten dira - jarduera eta funtzioa duten zelulak bezala. Hala ere, PSC-tik eratorritako gibeleko organoak aldaketa epigenetikoak eta genetikoak jasan ditzakete, analifikazioan zehar aneuposomia kromosomikoak ikusita.

Aplikazioak:

1. 1). Gibeleko Gaixotasun Ereduak
2. 2). Gibeleko gaixotasun infekziosoak ereduak
3. 3). Droga zitotoxikotasun probak

② Gibeleko ehuna - eratorritako zelulak: hauek dira cholangiozitoak eta hepatozitoak. Hepatozito helduek zelula zurtoin potentziala eta ugaritasuna mantentzen dituzte ingurune jakin batzuetan. PSC - eratorritako organoak alderatuz, ehun nagusietatik eratorritako organoak helduagoak dira, genoma egonkorragoak dituztela eta egonkortasun fenotipikoa eta genetikoa mantentzen dute aspaldidan zehar vitro kulturan. Hala ere, hepatozito organoide helduentzako epe luzea da. Hepatocyte organoak helduek erronka izaten jarraitzen dute.

Kultura metodoa (6. irudia): gibeleko ehuna zelula bakarretan digeritzen da eta matrigel eta zelulen nahasketa 24 - Well Plate Dome - formako egiturak osatzeko. 15 minutuz zelulen kulturaren inkubagailu batean inkubatu (37 ° C). Solidatu ondoren, gehitu kultura-euskarri espezifikoa. Igarotzea 14 egun igaro ondoren. Ordeztu jatorrizko euskarria bereizketa-euskarriarekin 7 - 10 egun ondoren.

Aplikazioak:

1. 1). Hepatotoxikotasun ereduak
2. 2). In vitro metabolismoaren nahasteen azterketak
3. 3). NON - Gantz alkoholiko gaixotasun gaixotasuna
4. 4). Gibeleko gaixotasun oneko eta gaiztoak garatzeko garapena

6. irudia. Kultura eta igarotze ehunaren prozesua - Gibeleko organoak eratorriak

Iturria: Zelula eta biozientzia (2023) 13: 197

Spheroid Kultura eta Organoa Kultura alderatuz

4. HEPATOCYTE CO primarioa Kultura eredua

1. 1. HEPATOCYTE CO 2D Lehenengo Kultura Eredua
      

      Hepatocyte CoSeo Lehenengo 2Dan Kultura eredua, bi zelula mota desberdin edo gehiago nahastu eta bi dimentsiotako ingurunean nahastu eta kulturatzen dira. Eredu honen funtsezko ezaugarria zelula mota desberdinen arteko interakzio zuzena da, zelulen eta zelulen arteko elkarreragina edo zeharkako seinaleen transmisioa zitokinien eta komunikazio kimikoen bidez. Hepatocyte funtzio primarioak, hala nola albumen ekoizpena eta drogak metabolismoaren gaitasuna, hiru astera arte mantendu daitezke.

      Aplikazioak:

      1. 1). Hepatocytes Cois - Fibroblastoekin kulturatua: eredu hau konposatu motela eta metabolitoak metabolizatzeko aukeraketa-tasa aztertzeko erabiltzen da.
      2. 2). Hepatocytes CoLeS - gibeleko parenchymalen (e) rekin batera, zelulak, zelula erorikoak dira.
      3. 3). Hepatocytes Cois - T zelulekin kulturatua: Eredu hau gibeleko drogen metabolismoa hautemateko erabiltzen da - T zelulen erantzun zehatzak.
      4. 4). IPhase hepatomax ™CO - Kultura Sistema: Iphase-k CO - kultura sistema garatu du espezie desberdinetako hepatozito primarioekin, Hepatomax izenarekin ezagutzen denaMe. CO - by giza hepatozito nagusiak zelula estromalekin landatuz, posible da droga ona mantentzea - gizakien hepatozitoetan entzima jarduera metabolizatzea 3 astez arte. Sistema hau egokia da motela ikasteko konposatu-tasak eta haien metabolitoak metabolizatzeko.

      Kultura eredu honek drogak metabolismoa, toxikotasuna eta gibela ebaluatzeko plataforma fisiologikoagoa eskaintzen du.
      
      

      3D Hepatocyte Co - Kultura eredua

      Direct 3D Co - Kultura: Eredu honek bi gibeleko zelula mota (adibidez, hepatozito nagusiak, zelula sinusoidealak, zelula sinusoideak, kupffer zelulak) nahastea dakar. Direct 3D CO - Culture-k gibeleko zelula desberdinen arteko elkarreragina itxi dezake zelula bezalako mekanismoen bidez.

      Aplikazioak:

      1. 1). Gibeleko fibrosi eredua: gibeleko fibrosi mekanismoak eta progresioa aztertzeko erabiltzen da.
      2. 2). Droga - Induzitutako gibeleko lesioa (DILI) eredua: drogak eragindako gibeleko kalteak simulatzen eta ebaluatzen laguntzen du.
      3. 3). Droga-interakzioak, drogen metabolismoa eta entzimaren indukzioa: droga ezberdinek nola elkarreragiten duten ebaluatzen du, nola metabolizatzen diren eta gibeleko entzimak nola eragiten duten.

      Zeharkako 3D CO - Kultura: Metodo honek bereizketa sistema fisikoa (adibidez, transwell edo beste material batzuk) erabiltzen ditu bi zelula mota edo gehiago, esaterako, NIH / 3T3 zelula sinusoideekin edo zelula sinusoidikoekin. Zelulen arteko komunikazioa zitokina disolbagarriak dira.

      Aplikazioak:
      Gorputzean gibeleko zelulen arteko harremanetarako komunikazioa ikasteko erabiltzen da.

      
      Laburbilduz, Iphase-k, In Vitro Ikerketa Biologikoko lider gisa, irtenbide integralak eskaintzen ditu droga klinikoko probak egiteko. Hainbat espezieetako hepatozito primarioen isolamendu eta kulturatik, hala nola, aplikazio espezifikoetarako edo anitzekoa da. Farmazia industriako bezeroentzako fidagarritzat jotzen dugu, ebaketa egiteko konpromisoa - Ikerketa klinikoetarako.