Indusoitu rotan maksan S9 -fraktio: metabolinen aktivaatiojärjestelmä in vitro genotoksisuus- ja mutaatiotesteille

Avainsanat: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, mutaatiotesti, genotoksisuus, geneettinen toksisuus, indusoitu rottamaksa S9, AMES -testi, mini -testi, kromosomaalinen absoluutti, mikronukle, HPRT/HGPRT -määritys

Iphase -tuote

Esittely

Indusoitu rotan maksa S9on avainkomponentti arvioitaessageneettinen toksisuusKemikaalien potentiaali, etenkin säätelytoksikologiassa. Sitä käytetään yleisesti yhdessä in vitro -määritysten kanssa, kutenAmes -testi jamutaatiotestit, arvioida yhdisteiden mutageenisia ominaisuuksia. Tarjoamalla entsymaattista järjestelmää, joka on runsaasti sytokromi P450: llä (CYP450), indusoidulla rotan maksan S9 -fraktiolla on ratkaiseva rooli maksassa tapahtuvien metabolisten prosessien simuloinnissa, mikä auttaa kemikaalien aiheuttamisessa geneettisiä mutaatioita vai syöpää.

Indusoitu rotan maksa S9

Maksan S9 -fraktio viittaa pylvään - mitokondriaaliseen supernatanttiin, joka on saatu rotan maksan homogenaateista sentrifugointivaiheiden sarjan jälkeen. Termi "indusoitu" viittaa rottien hoitoon spesifisillä yhdisteillä, jotka parantavat maksaentsyymien, erityisesti sytokromi P450 -entsyymien (CYP450) aktiivisuutta, jotka ovat vastuussa monen ksenobioottisen valikoiman aineenvaihdunnasta.

Indusoitu rottamaksan S9 -fraktio sisältää erilaisia ​​entsyymejä, jotka ovat mukana kemikaalien vaiheen I ja vaiheen II aineenvaihdunnassa. Tähän sisältyy entsyymejä, kuten sytokromi P450 -monooksigenaasit, jotka helpottavat substraattien oksidatiivista biotransformaatiota, mikä jäljittelee ihmisen maksan aineenvaihduntaa.

CYP450 -aktiivisuus ja metabolinen aktivointi

Sytokromi P450 -entsyymiperheellä (CYP450) on keskeinen rooli monenlaisten aineiden aineenvaihdunnassa, mukaan lukien monet lääkkeet, ympäristökemikaalit ja karsinogeenit. Indusoitu rottamaksan S9 -fraktio sisältää nämä entsyymit ja on välttämätöntä kemikaalien arvioimiseksi, joista voi tulla vain genotoksista metabolisen aktivoinnin jälkeen.

Monet yhdisteet ovat alun perin ei -- myrkyllisiä, mutta niistä voi tulla myrkyllisiä maksan aineenvaihdunnan jälkeen. Nämä pro - mutageenit (jotka vaativat metabolisen aktivaation muuttuvan mutageeniseksi) ja pro - karsinogeenit (jotka vaativat aktivoitumista syövän aiheuttamiseksi) voidaan havaita vain määrityksillä, jotka sisältävät S9 -metabolisen aktivointijärjestelmän. Ilman metabolisten entsyymien, kuten CYP450, indusointia, nämä aineet voivat näyttää olevan vaarattomia tavanomaisissa genotoksisuuskokeissa.

Lisäämällä indusoidut rotan maksan S9 in vitro -määrityksiin, tutkijat voivat arvioida, kuinka aine on vuorovaikutuksessa CYP450 -entsyymien kanssa. Tämä on erityisen tärkeää lääkkeille, koska CYP450 -entsyymien aineenvaihdunta on kriittinen vaihe monien lääkkeiden farmakokinetiikassa.

Indusoidun rotan maksan S9 -sovellukset

1. 1. Ames -testi (OECD 471)

Ames -testi, hahmoteltu ohjeessaOECD 471, on yksi kaikkein tunnetuimmista ja laajalti käytetyistä menetelmistä mutageenisuuden arvioimiseksi. Salmonella -bakteerien kantojen paljastaminen testikemikaalille voidaan nähdä, indusoi se mutaatioita, jotka saavat bakteerien palautumaan histidiiniin - riippumattomaan tilaan.

Ihmisen metabolisen prosessin simuloimiseksi indusoitu rotan maksa S9 lisätään usein testijärjestelmään. S9 -fraktio tarjoaa tarvittavat entsyymit, mukaan lukien CYP450, jota voidaan tarvita yhdisteen metaboloimiseksi reaktiivisempaan muotoon, joka voi aiheuttaa mutaatioita bakteerien DNA: ssa. Tämä S9 -yhdistelmä AMES -testiin mahdollistaa kattavamman arvioinnin mutageenisesta potentiaalista jäljittelemällä sekä suoria että metabolisesti aktivoituja mutageenisia mekanismeja.

2. 2.Mutaatiotestit (kromosomaaliset poikkeamat testi, mikronukleuskoe ja muut in vitro -määritykset)

AMES -testin lisäksi mutaatiotestejä käytetään yleisesti kemikaalien genotoksisen potentiaalin arviointiin. Nämä testit ovat kattavampia arvioitaessa erilaisia ​​geneettisiä vaurioita, mukaan lukien kromosomaalimutaatiot, geenimutaatiot ja mikronukleiden muodostuminen. Indusoitua rottamaksaa S9 käytetään mutaatiokokeissa seuraavista syistä:

Mikronukleustesti (OECD 487)

Tämä testi havaitsee mikronukleiden muodostumisen soluissa, jotka ovat pieniä, eksranukleaarisia kappaleita, jotka sisältävät fragmentteja kromosomeista tai kokonaisista kromosomeista, joita ei ole sisällytetty ytimeen solun jakautumisen aikana. Se mikronuklivoi havaita klastogeenisiä (kromosomi - rikkoutumista) ja aneugeenisia (vaikuttavia kromosomien lukumäärää) vaikutuksia. Tässä käytetään indusoitua rotan maksa S9: tä testiaineen aktivoimiseksi metabolisesti, koska jotkut kemikaalit aiheuttavat vain kromosomaalisia vaurioita, kun maksaentsyymit ovat metaboloineet ne. S9 -fraktio parantaa testin herkkyyttä simuloimalla metabolista aktivaatiota, jota voi esiintyä in vivo.

Kromosomaalinen poikkeavuuskoe (OECD 473)

Tässä testissä arvioidaan, voiko aine aiheuttaa kromosomien rakenteellisia vaurioita indusoimalla taukoja, deleetioita, siirtymiä tai muun tyyppisiä poikkeavuuksia. Kuten mikronukleustesti,kromosomaalinen poikkeavuuskoevoidaan levittää aineenvaihdunnan aktivoitumisen kanssa tai ilman sitä. Testijärjestelmään lisätään indusoitu rottamaksa S9 jäljittelemään maksan metabolisia prosesseja, jolloin voidaan arvioida aineita, jotka eivät välttämättä aiheuta kromosomaalisia vaurioita alkuperäisessä muodossaan, mutta voivat tehdä niin maksan aineenvaihdunnan jälkeen.

Taulukko 1. Mutaatiotestien vertailevat näkökohdat

HPRT/HGPRT -määritys (OECD 476)

SiinäHPRT/HGPRT -määritys, kiinalaisen hamsterin (CHO tai V79) tai ihmisen lymfoblastoidien (TK6) solujen viljelmät altistuvat testikemikaalille indusoidun rotan maksan S9 -metabolisen seoksen läsnä ollessa, joka toimittaa CYP450 -entsyymit, joita tarvitaan pro -mutageenien muuttamiseksi DNA -reaktiivisiksi lajiksi. Lyhyen hoidon ja seitsemän päivän ekspressiojakson jälkeen solut haastetaan 6 -tioguaniinilla; Vain hypoksantiini -guaniinin foshoribosyylitransferaasigeenin hypoksantiini -guaniinihäviömutatiot säilyvät. Vertaamalla mutanttipesäkkeitä yleiseen elinkykyisyyteen, tutkijat määrittävät mutaatiotaajuuden, joka, jos se on toistuvasti kohonnut sekä samanaikaisten että historiallisten kontrollien aikana, osoittaa genotoksisen potentiaalin.

TK -määritykset (OECD 490 & OECD 476)

SeTK -määritys Käyttää joko L5178y -hiiren lymfoomasoluja (OECD 490) tai CHO -soluja (OECD 476) suunniteltu heterotsygoottinen tymidiinikinaasilokukseen. Kemiallisen altistumisen ± S9 -sekoituksen jälkeen solut palautuvat ja maljataan väliaineeseen, joka sisältää trifluoritymidiiniä, joka tappaa TK -profatiiviset solut. Selviytyneet TK⁻ -mutantit muodostavat pesäkkeitä 10–14 päivän ajan, ja pienen kolonimutantit heijastavat usein kromosomaalisia tapahtumia ja suurten koloniamutantteja, jotka heijastavat pistemutaatioita. Kuten HPRT/HGPRT -määrityksessä, tiukat sytotoksisuuden kontrollit ja positiiviset mutageenin vertailuarvot varmistavat, että havaitut mutaatiotaajuuden lisääntymiset heijastavat luotettavasti yhdisteen genotoksista riskiä.

4. 4. Syöpäriskin arviointi

Indusoitua rottamaksaa S9 käytetään myös tutkimuksissa, joiden tarkoituksena on arvioida syöpää - Aineiden potentiaalin aiheuttamista. Simuloimalla ihmisen maksassa tapahtuvia metabolisia prosesseja S9 -fraktio voi auttaa tunnistamaan yhdisteitä, jotka voivat johtaa reaktiivisten metaboliittien muodostumiseen, jotka kykenevät sitoutumaan DNA: han ja aiheuttamaan mutaatioita, jotka voivat johtaa syöpään.

Parannettu AMES -testi indusoidulla hamsterimaksalla S9

Eurooppalaisen lääkeviraston (EMA) antamien viimeisimpien ohjeiden mukaan perinteinen AMES -testi ei ehkä ole riittävän herkkä muun muassa tiettyjen N - nitrosamiinin epäpuhtauksien, erityisesti N - nitrosodimetyyliamiinin (NDMA) mutageenisen potentiaalin havaitsemiseksi. Siksi Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkehallinnon (FDA) jakautumisen (FDA) kansallisen toksikologisen tutkimuksen keskuksen (NCTR) kehittämää tehostettua AMES -testiä on suositeltu luotettavampana vaihtoehtona. Parannettu AMES -testi esitteli indusoidun hamsterimaksan S9 lisäämisen, joka suoritti 30% rotan maksan S9 ja 30% hamsterin maksan S9. Rotta- ja hamsterin desmosomaaliset supernatantit (S9S) tulisi valmistaa jyrsijöiden maksasta, joita on käsitelty sytokromi P450 -entsyymillä - indusoivilla aineilla. Käyttämällä indusoitua hamsteri maksa S9: tä, tämä tehostettu testi simuloi paremmin ihmisen aineenvaihduntaa ja lisää tulosten luotettavuutta.

Johtopäätös

Indusoitu rottamaksa S9 toimii kriittisenä työkaluna genotoksisuuden testauksessa, auttaen tutkijoita ja sääntelyvirastoja arvioimaan kemikaalien mutageenisia ja karsinogeenisiä potentiaaleja. Tarjoamalla metabolisen aktivaatiojärjestelmän, se parantaa määritysten, kuten AMES -testin, mutaatiokokeiden ja CYP450 -aktiivisuustutkimusten kykyä, havaita aineita, jotka vaativat metabolista aktivaatiota genotoksiseksi. Sen sovellukset ovat välttämättömiä uusien lääkkeiden, kemikaalien ja kuluttajatuotteiden turvallisuuden varmistamiseksi. Indusoitu rotan maksan S9 -fraktio on ihmisen maksan aineenvaihdunnan simuloinnissa edelleen välttämätön osa nykyaikaisia ​​toksikologiaa ja sääntelyturvallisuusarviointeja.