Primaarinen hepatosyytit: tärkeä työkalu ei -- kliinisten lääkkeiden tutkimuksen edistämiseksi

Primaarinen hepatosyytit: tärkeä työkalu ei -- kliinisten lääkkeiden tutkimuksen edistämiseksi

Maksa, joka on lääkkeen altistumisen ensisijainen elin, on ratkaiseva rooli lääkkeen aineenvaihdunnassa ja toksisuusprosesseissa. Ensisijaisilla maksasoluilla on entsyymien ja kofaktorien soluominaisuuksien ja fysiologisten tasojen täydellinen spektri, mukaan lukien membraani - sitoutuneet entsyymit, kuten sytokromi p450 (sekoitettu - funktiooksidaasi sileässä endoplasmisessa retikulumissa) ja sytosoliesteraaseissa, jotka kattavat kaikki maksujen metaboliset polut, jotka löydettiin liveristä. Tästä syystä primaarisia maksasoluja pidetään laajalti kultastandardina in vitro maksamallien rakentamisessa, ja tutkijat suosittelevat niitä lääkkeiden vuorovaikutuksessa, lääkkeen aineenvaihdunnassa ja toksisuustutkimuksissa. Tämä artikkeli tarjoaa yleiskuvan 2D- ja 3D -kulttuurimalleista, jotka perustuvat primaarisiin maksasoluihin ja niiden sovelluksiin lääkekehityksessä.

Avainsanat: Ensisijaiset maksasolut, 2D -viljely, 3D -viljely, organoidit, CO - kulttuuri.

1. 1. Primaaristen maksasolujen eristäminen

Primaaristen maksasolujen eristäminen on kriittinen vaihe in vitro maksa -mallien määrittämisessä, kun kaksi - vaiheen kollagenaasin perfuusiomenetelmää käytetään yleisimmin. Pienemmillä eläimillä maksan perfuusio voidaan suorittaa portaalisuonen tai ala -arvoisen vena cavan kautta, kun taas suuret eläimet vaativat tyypillisesti perfuusion maksan lohkojen tai segmenttien kautta. Useat avaintekijät vaikuttavat hepatosyyttien onnistuneeseen eristämiseen: Ensinnäkin kollagenaasin tulisi olla ei - sytotoksinen. Toiseksi ruuansulatuksen ajoitus on ratkaisevan tärkeää -Molemmat - ruuansulatuksen ja yli - ruuansulatus voivat vaarantaa hepatosyyttien saannon ja elinkelpoisuuden. Kolmanneksi, maksan olosuhteiden on oltava optimaalisia, koska hepatosyytit ovat erittäin herkkiä iskeemisille vaurioille. Maksasolujen valmistukseen käytetty maksa tulee jäähtyä nopeasti aineenvaihdunnan nopeuksien vähentämiseksi ja metabolisen hypoksian ja sitä seuraavan iskemian estämiseksi.

Lääketutkimuksessa käytettyjen primaaristen maksasolujen standardit ovat seuraavat:

1. 2. Ensisijainen hepatosyyttikulttuuri

Suspensio hepatosyyttimalli

Se sisältää täydellisen lääkkeen - metabolisoivat entsyymit ja kofaktorit, mikä tekee siitä sopivan erilaisten aineenvaihduntaryhmien reittien tutkimiseen. Suspensio hepatosyyttien elinkelpoisuus ja lääkkeen aktiivisuus - metaboloivat entsyymit vähenevät vähitellen in vitro -inkubaatioajan kasvaessa rajoittaen inkubaatioajan korkeintaan 4 tuntiin. Tätä mallia käytetään tyypillisesti arvioimaan lääkkeiden puhdistuma, jolla on kohtalainen tai korkea puhdistuma. Kun puhdistusaste on alle 20%, tarkkoja puhdistuma -arvoja ei voida määrittää. Perinteinen suspensio hepatosyytti - In vitro -metaboliamallit ovat riittämättömiä havaittavissa olevien metabolisten reaktioiden tuottamiseksi hitaille - metabolisoiville yhdisteille, mikä rajoittaa niiden kykyä ennustaa näiden yhdisteiden puhdistuma- ja metabolisia tuotteita. Suspensio hepatosyyttirelemenetelmää (kuva 1) voidaan käyttää inkubaatioajan pidentämiseen 20 tuntiin tai jopa pidempään.

Sovellus:Pienten molekyylisten lääkkeiden entsyymiaktiivisuus ja metaboliset stabiilisuustutkimukset.

Kuva 1. Suspensio hepatosyyttireleen menetelmän siirtoprosessi

Lähde: Drug Metab Dispos, 2012 40 (9): 1860–1865

Taavittava hepatosyyttimalli

Ensisijaisia ​​maksasoluja viljellään 2D -järjestelmässä kollageenilla - päällystetyt viljelylevyt. Hepatosyyteillä on epiteelimorfologia, jolla on ulkoneva ytimet, jotka esiintyvät usein binukletoidussa muodossa. Yhden hepatosyytin yksikerroksisen viljelmän haittoja ovat: 1. solujen napaisuuden ja toiminnan muutos.2. Muiden asiaankuuluvien solutyyppien (ts. Ei - parenyymisolujen) puute, joita tarvitaan normaaliin toimintaan.3. Kyvyttömyys tarjota riittävästi ravintoaineita ja parakriinitekijöitä hepatosyyttien tukemiseksi niiden toimintojen suorittamisessa (kuten sappihappo ja seerumiproteiinien biosynteesi).

Sovellukset:

1). Lääkkeen - Lääkehukeiden vuorovaikutusten arviointi:Tähän sisältyy entsyymien induktio, entsyymin estäminen ja kuljetustutkimukset. Ensinnäkin, kun lääke toimii indusoijana, se voi johtaa lääkkeen lisääntyneeseen ekspressioon, joka metaboloi entsyymejä ja kuljettajia. Vahvat induktorit voivat säädellä useita geenejä samanaikaisesti, kuten CYP2B6: n, CYP3A4: n, CYP2C9: n, UGT: n ja useiden kuljetusproteiinien, kuten MRP2: n, fenobarbitaalisen induktion. Toiseksi on olemassa lajeja - erityisiä eroja siinä, kuinka hepatosyyttit reagoivat indusoijiin. Esimerkiksi rifampisiini on tehokas indusoija ihmisen ja kanin maksasoluille, mutta sillä ei ole induktiovaikutusta rotan hepatosyytteihin. Lopuksi, verhottujen hepatosyyttien suboptimaalinen pinnoitustiheys voi johtaa P450: n vähentyneeseen perusetuun ja keinotekoisesti lisääntyneisiin induktiovasteisiin. Kuten kuviossa 3 esitetään, hepatosyytteillä alhaisemmassa pinnoitustiheydessä osoittavat CYP1A2: n, CYP2B6: n ja CYP3A4: n alhaisemman perusaktiivisuuden, mutta voimakkaammat induktiovasteet. Siksi terveelliset maksasolut sopivalla pinnoitustiheydellä ovat välttämättömiä fysiologisesti merkityksellisten tietojen saamiseksi.

Kuvio 2. Kylmäsäilytettyjen ihmisen hepatosyyttien ja entsyymien induktion pinnoitustiheyden suhde

Lähde: Nykyinen Drug Discovery Technologies, 2010, 7: 188 - 198

2). Maksatoksisuuden arviointi: Tarkkailemalla morfologisia muutoksia valomikroskoopissa, kuten solumorfologia, tyhjö ja lipidipisaran aggregaatio ja solujen kiinnittyminen/irrottaminen. Hepatosyytin nekroosin havaitseminen (kuten aspartaatin aminotransferaasi, laktaattidehydrogenaasi ja alaniinin aminotransferaasi) ja apoptoosin (DNA -fragmentoituminen). Sytokiini - välitetyt sytotoksisuus hepatosyyttien yksittäiset yksikerroksiset viljelmät eivät voi ennustaa myrkyllisiä vasteita naapurimaiden ei -- parenyymisolujen, kuten Kupffer -solujen, tähtien solujen ja sinusoidisten endoteelisolujen, säätelystä.

3). "Rele menetelmä" hitaan metabolisoivan yhdistelmäpuhdistuksen ja sen metaboliittien tutkimiseksi: Lääkkeen aktiivisuus - Sen jälkeen kun se on inkuboinut tyylikkäät maksasolut, joissa on seerumia

Kuvio 3. Taapii hepatosyyttirelemenetelmän siirtoprosessi

Lähde: Drug Metabolism Letters, 2016, 10: 3 - 15

3). Arvioi solujen imeytyminen, endosytoosi, endosomaalinen poistuminen ja vaimennusvaikutukset hepatosyytin kohdennettuihin geeniin - kohdennettuja pieniä nukleiinihappolääkkeitä.

Voileipäviljelymalli

In vitro hepatosyyttejä voidaan viljellä kahden kollageenikerroksen tai Matrigelin kerroksen välillä rekonstruoimiseksi in vivo -rakenteissa, joita kutsutaan voileipäviljelyksi. Kahden geeli - kollageenikerroksen (voileipärakenne) välissä viljellyt maksasolut voivat parantaa solujen morfologiaa ja elinkelpoisuutta ja säilyttää niiden toiminnallisuutta pidemmän ajan. Lisäksi Sandwich -viljelmän hepatosyytit voivat palauttaa polaarisuuden, mikä mahdollistaa basolateraalisten ja kanava -kuljettajien asianmukaisen lokalisoinnin sekä funktionaalisten sappikanavan verkkojen muodostumisen (kuva 4).

Kuvio 4. Kuljettajien polarisoitu ekspressio ihmisen hepatosyytin voileipämallissa

Lähde: Nykyinen Drug Discovery Technologies, 2010, 7, 188 - 198

Sovellukset:

1. 1). Yhdisteiden sappien erittymisen arviointi.
2. 2). Endogeenisten ja eksogeenisten yhdisteiden ja metaboliittien maksa- ja sappijakauman arviointi.
3. 3). Metabolian ja kuljettajien välittämät puhdistuman arviointi ja fysiologian rakentaminen - Pohjaiset farmakokineettiset mallit.
4. 4). Maksatoksisuuden tutkiminen ja mekanismien tarjoaminen kliiniselle lääkkeelle - aiheuttama maksavaurio. Tiedot on integroitu systeemi -farmakologiamalleihin mahdollisen lääkkeen aiheuttaman maksavaurion ennustamiseksi ihmisillä.
5.  
   1. 3. Ensisijainen hepatosyyttikulttuuri

6. 3D -viljelyjärjestelmissä hepatosyyttejä viljellään kolmessa - ulottuvuusmatriisissa, joka jäljittelee paremmin in vivo -maksaarkkitehtuuria verrattuna 2D -yksikerroksen kulttuureihin. Nämä järjestelmät edistävät solu- ja solujen - matriisivuorovaikutuksia, jotka voivat palauttaa enemmän maksan fysiologisia toimintoja, mukaan lukien lääkkeen aineenvaihdunta, proteiinien eritys ja sapen muodostuminen. Primaarista maksasolujen 3D -viljelmiä voidaan käyttää maksan tutkimiseen - Erityisten toimintojen tutkimiseen in vivo - kuten ympäristö, joka tarjoaa etuja lääkkeiden testaamiseen, toksisuuden arviointiin ja sairauksien mallintamiseen.

   Sferoidimalli

Tekniikoiden, kuten ultra - matalan kiinnittymisviljelyn, ripustettujen pudotusviljelmien ja magneettisen soluviljelmän (kuva 5) kautta (kuva 5), ​​primaariset maksasolut voivat aggregoida pallomaisiksi aggregaateiksi, joiden halkaisija on jopa 150 - 175 µm luottamatta ulkoisiin matriisiin. Yksi sferoidiviljelmän etu on, että jokainen pallomoidi vaatii vain 1 330 - 2 000 solua, mikä vähentää merkittävästi solujen lukumäärää muihin 3D -viljelytekniikoihin verrattuna. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että primaariset maksasolujen sfheroidiviljelmät voivat ylläpitää jopa 5 viikkoa, kun CYP -entsyymiaktiivisuus on jäljellä melkein ennallaan päivän 8 ja 35 päivän välillä. Proteomianalyysi paljasti, että verrattuna voileipäviljelmään, entsyymit, jotka vastaavat lääkkeen imeytymisestä, jakautumisesta, aineenvaihdunnasta ja erittymisestä, ovat parempia 14 päivän ajan spheroid -kulttuurissa. Maksa on kuitenkin paljon monimutkaisempi kuin solun aggregaatti. Hepatosyyttien basolateraalinen puoli on vuorovaikutuksessa veren kanssa, kun taas sappi virtaa apikaalisesta puolelta, mikä on kompleksisen maksan lobule -rakenteen avainpiirre, eikä tätä voida vielä toistaa sferoidimallissa.

Sovellukset:

1. 1). Tutkimus hitaasta metabolisoivasta yhdistelmäpuhdistumisesta ja sen metaboliitteista.
2. 2). Hepatoksisuustutkimus.
3. 3). Solujen imeytymisen, endosytoosin, endosomaalisen poistumisen ja vaimennusvaikutusten arviointi hepatosyytin kohdennettuihin geeneihin - kohdennettuihin pieniin nukleiinihappolääkkeisiin.

Kuva 5. Sferoidikulttuurimenetelmä

Maksan organoidimalli

Organoidien konsensusmääritelmä on: kantasoluista, progenitorisoluista tai erilaistuneista soluista johdetut 3D -rakenteet, jotka kykenevät toistamaan tiettyjä alkuperäisen kudoksen toimintoja ja rakenteita in vitro, jäljittelemällä tehokkaasti in vivo -mikroympäristöä ja soluja - soluvuorovaikutuksia. Maksan organoidit on tunnistettu edistyneimmänä mallina ihmisen maksabiologian tutkimukselle.

Maksan organoidirakenteen solulähteet:

Pluripotentiset kantasolut (PSC):

Alkion kantasoluilla (ESC) ja indusoiduilla pluripotensilla kantasoluilla (IPSC) on korkea pluripotenssi, plastisuus ja rajoittamaton proliferatiivinen kapasiteetti. Spesifisten signalointitekijöiden vaikutuksesta ne eroavat hepatosyytteiksi - kuten solut, joilla on aktiivisuus ja toiminta. PSC: stä johdetut maksa organoidit voivat kuitenkin käydä läpi epigeneettisiä ja geneettisiä muutoksia, joilla on kromosomaaliset aneuploidiamuutokset monistumisen aikana.

Sovellukset:

1. 1). Geneettiset maksasairausmallit
2. 2). Tarttuvat maksasairausmallit
3. 3). Lääkkeiden sytotoksisuustestaus

② Maksakudos - Johdetut solut: Näihin kuuluvat kolangiosyyttit ja hepatosyytit. Kypsät maksasolut säilyttävät kantasolupotentiaalin ja proliferatiivisen kyvyn tietyissä ympäristöissä. Verrattuna PSC -: n johdettuihin organoideihin, primaarisesta kudoksesta johdetut organoidit ovat kypsempiä, stabiilimpien genomien kanssa ja ylläpitävät fenotyyppistä ja geneettistä stabiilisuutta pitkän - termin in vitro -viljelmän aikana. Ihmisen kypsien hepatosyyttien organoidien pitkä - termi proliferatiivinen kapasiteetti on kuitenkin rajoitettu verrattuna ihmisen sikiön hepatosyytteihin tai aikuisten hiiren primaarisiin maksasoluihin. Aikuisten hepatosyyttien organoidien viljely on edelleen haastavaa.

Viljelymenetelmä (kuvio 6): Maksakudos pilkotaan yksittäisiin soluihin, ja Matrigelin ja solujen seos kylvetään 24 - kaivolevyyn kupolin muodostamiseksi. Inkuboi soluviljelyinkubaattorissa (37 ° C) 15 minuutin ajan. Lisää jähmettymisen jälkeen tietty viljelyalusta. Kulku noin 14 päivän kuluttua. Vaihda alkuperäinen väliaine erotteluväliaineella 7 - 10 päivän kuluttua.

Sovellukset:

1. 1). Maksatoksisuusmallit
2. 2). In vitro -metabolian häiriötutkimukset
3. 3). Ei - alkoholinen rasvamaksatauti
4. 4). Huumeiden kehitys hyvänlaatuisille ja pahanlaatuisille maksasairauksille

Kuva 6. Kuolto- ja kulkuprosessi - Johdetut maksa -organoidit

Lähde: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

Sferoidikulttuurin ja organoidikulttuurin vertailu

4. Ensisijainen hepatosyytti CO - Kulttuurimalli

1. 1. 2D -ensisijainen hepatosyytti CO - Kulttuurimalli
      

      2D: n primaarisessa hepatosyyttikierroksessa viljelymallissa kaksi tai useampia erilaisia ​​solutyyppejä sekoitetaan ja viljellään kahdessa - ulottuvuusympäristössä. Tämän mallin keskeinen piirre on suora vuorovaikutus eri solutyyppien, solujen ja solunulkoisen matriisin välinen vuorovaikutus tai epäsuora signaalin siirto sytokiinien ja kemiallisen viestinnän kautta. Primaariset hepatosyyttitoiminnot, kuten albumiinin tuotanto ja lääkkeiden aineenvaihdunta, voidaan ylläpitää jopa kolme viikkoa.

      Sovellukset:

      1. 1). Ensisijaiset maksasolut Co - viljelty fibroblasteilla: Tätä mallia käytetään hitaan - metabolisoivien yhdisteiden ja niiden metaboliittien puhdistusnopeuden tutkimiseen.
      2. 2). Primaariset maksasolut CO - Viljelty ei -- parenyymisilla maksasoluilla (esim. Stellaattisolut, sinimuotoiset endoteelisolut): Tämä malli on hyödyllinen lääkkeen indusoimien maksavaurioiden (DILI) tutkiessa, koska se auttaa tutkimaan sytokiinien, kemokiinien ja kasvutekijöiden roolia lääkkeen altistuksen jälkeen.
      3. 3). Primaariset maksasolut CO - T -soluilla viljellään: Tätä mallia käytetään maksalääkehaineenvaihdunnan havaitsemiseksi - spesifiset T -soluvasteet.
      4. 4). Iphase's Hepatomax ™CO - Viljelyjärjestelmä: Iphaasi on kehittänyt CO - -viljelyjärjestelmän, jossa on primaarisia hepatosyyttejä eri lajeista, tunnetaan nimellä Hepatomax™. CO - Ihmisen primaaristen maksasolujen viljelyllä stroomasolujen kanssa on mahdollista ylläpitää hyvää lääkettä - metaboloiva entsyymiaktiivisuus ihmisen hepatosyyteissä jopa 3 viikon ajan. Tämä järjestelmä sopii hitaan - Metabolisoimaan yhdistymisnopeuden ja niiden metaboliittien metabolisointia.

      Tämä CO - -viljelymalli tarjoaa fysiologisesti merkityksellisemmän alustan lääkkeen aineenvaihdunnan, toksisuuden ja maksan - siihen liittyvien sairausprosessien arvioimiseksi tarjoamalla tietoa siitä, kuinka eri solutyypit edistävät maksan toimintaa ja sairautta.
      
      

      3D -ensisijainen hepatosyytti CO - Kulttuurimalli

      Suora 3D CO - Kulttuuri: Tämä malli käsittää kahden tai useamman erityyppisen maksasolujen (esim. Primaaristen hepatosyyttien, sinimuotoisten endoteelisolujen, maksastellaattisolujen, Kupffer -solujen) sekoittaminen itse - koottujen sferoidien tai CO: n viljelyyn 3D -ympäristössä, joka on rakennettu materiaaleissa, kuten kollagenissa, fibriinissä, alginissa, tai hydrogeelissa. Suora 3D CO - Viljely mahdollistaa tiiviin vuorovaikutuksen eri maksasolujen välillä mekanismien, kuten solu - - solujen tarttumisen, parakriinin signaloinnin avulla liukoisten sytokiinien ja solunulkoisen matriisin tarttumisen kautta, mahdollistaa viestinnän hepatosyyttien välillä.

      Sovellukset:

      1. 1). Maksafibroosimalli: Käytetään maksafibroosin mekanismien ja etenemisen tutkimiseen.
      2. 2). Lääke - Indusoitu maksavaurio (DILI) -malli: auttaa simuloimaan ja arvioimaan lääkkeiden aiheuttamia maksavaurioita.
      3. 3). Lääkkeiden vuorovaikutukset, lääkkeen aineenvaihdunta ja entsyymien induktio: Arvioi kuinka erilaiset lääkkeet ovat vuorovaikutuksessa, miten ne metaboloivat ja miten ne indusoivat maksaentsyymejä.

      Epäsuora 3D CO - Kulttuuri: Tämä menetelmä käyttää fyysistä erotusjärjestelmää (esim. Transwell tai muut materiaalit) viljelmään kahta tai useampaa soluatyyppiä (kuten primaariset hepatosyyttit NIH/3T3 -soluilla tai sinimuotoisilla endoteelisoluilla) 3D -ympäristössä, jossa suorat solut - solujen kontakti estetään. Kommunikaatio solujen välillä tapahtuu liukoisten sytokiinien kautta.

      Sovellukset:
      Käytetään kehon maksasolujen välisen kontaktiviestinnän tutkimiseen.

      
      Yhteenvetona voidaan todeta, että Iphaasi tarjoaa in vitro biologisen tutkimuksen johtajana kattavat ratkaisut ei -- kliinisiin lääkkeisiin. Erilaisista lajeista primaaristen hepatosyyttien eristämisestä ja kulttuurista tukevien tuotteiden, kuten viljelyväliaineiden kehitykseen tiettyihin sovelluksiin tai Multi - Specification -kollageeni - päällystetyt levyt, IPHase on omistautunut tarjoamaan parhaita in vitro -tutkimusvälineitä huumeiden löytämiseksi ja kehitykselle. Olemme luotettava kumppani lääketeollisuuden asiakkaille, jotka ovat sitoutuneet tarjoamaan leikkaamisen Edge Solutions ei - kliiniseen tutkimukseen.