Hépatocytes primaires: un outil crucial pour faire avancer la recherche de médicaments in vitro non clinique

Hépatocytes primaires: un outil crucial pour faire avancer la recherche de médicaments in vitro non clinique

Le foie, en tant qu'organe principal pour l'exposition aux médicaments, joue un rôle crucial dans le métabolisme des médicaments et les processus de toxicité. Les hépatocytes primaires possèdent le spectre complet des caractéristiques cellulaires et des niveaux physiologiques des enzymes et des cofacteurs, y compris les enzymes de la membrane - telles que le cytochrome P450 (une fonction d'oxydase mixte - dans le réticulum endoplasmique fluide) et les estérases cytosoliques, englobant toutes les voies métaboliques trouvées dans le cerveau. Pour cette raison, les hépatocytes primaires sont largement considérés comme l'étalon-or pour construire des modèles hépatiques in vitro et sont favorisés par les chercheurs dans l'interaction médicamenteuse, le métabolisme des médicaments et les études de toxicité. Cet article donne un aperçu des modèles de culture 2D et 3D basés sur les hépatocytes primaires et leurs applications dans le développement de médicaments.

Mots-clés: hépatocytes primaires, culture 2D, culture 3D, organoïdes, co - culture.

1. 1. Isolement des hépatocytes primaires

L'isolement des hépatocytes primaires est une étape critique pour établir des modèles hépatiques in vitro, la méthode de perfusion de collagénase à deux - étapes étant la plus couramment utilisée. Chez les petits animaux, la perfusion hépatique peut être effectuée via la veine portale ou la veine cave inférieure, tandis que les animaux plus gros nécessitent généralement une perfusion à travers des lobes ou des segments du foie. Plusieurs facteurs clés influencent l'isolement réussi des hépatocytes: premièrement, la collagénase devrait être non cytotoxique. Deuxièmement, le moment de la digestion est crucial -À la fois sous - digestion et sur - digestion peut compromettre le rendement et la viabilité des hépatocytes. Troisièmement, la condition hépatique doit être optimale, car les hépatocytes sont très sensibles aux dommages ischémiques. Le foie utilisé pour la préparation des hépatocytes doit être rapidement refroidi pour réduire les taux métaboliques et prévenir l'hypoxie métabolique et l'ischémie ultérieure.

Les normes pour les hépatocytes primaires utilisées dans la recherche sur les médicaments sont les suivantes:

1. 2. Culture 2D des hépatocytes primaires

Le modèle d'hépatocyte de suspension

Il contient un médicament complet - enzymes et cofacteurs métabolisants, ce qui le rend adapté à l'étude de diverses voies de dégagement métaboliques. Cependant, la viabilité des hépatocytes de suspension et l'activité des enzymes de métabolisation du médicament diminuent progressivement à mesure que le temps d'incubation in vitro augmente, limitant le temps d'incubation à un maximum de 4 heures. Ce modèle est généralement utilisé pour estimer la clairance des médicaments avec des taux de clairance modérés à élevés. Lorsque le taux de dégagement est inférieur à 20%, les valeurs précises de dégagement ne peuvent pas être déterminées. Hépatocyte de suspension traditionnelle - Les modèles de métabolisme in vitro sont insuffisants pour générer des réactions métaboliques détectables pour les composés lents - métaboliser, limitant ainsi leur capacité à prédire les taux de clairance et les produits métaboliques de ces composés. Une méthode de relais d'hépatocyte de suspension (figure 1) peut être utilisée pour prolonger le temps d'incubation à 20 heures ou même plus.

Application:Activité enzymatique et études de stabilité métabolique pour les médicaments à petites molécules.

Figure 1. Processus de transfert de la méthode du relais d'hépatocytes Suspension

Source: Drug Metab Dispos, 2012,40 (9): 1860–1865

Le modèle d'hépatocytes platepables

Les hépatocytes primaires sont cultivés dans un système 2D sur les plaques de culture en revêtement. Les hépatocytes présentent une morphologie épithéliale, avec des noyaux saillants, se présentant souvent sous une forme binucléée. Les inconvénients de la culture monocouche des hépatocytes simples comprennent: 1. Altération de la polarité et de la fonction cellulaire. Manque d'autres types de cellules pertinents (c'est-à-dire des cellules non - cellules parenchymateuses) qui sont nécessaires pour la fonction normale. Incapacité à fournir suffisamment de nutriments et de facteurs de paracrine pour soutenir les hépatocytes dans l'exécution de leurs fonctions (comme l'acide biliaire et la biosynthèse des protéines sériques).

Applications:

1). Évaluation du médicament - Interactions médicamenteuses:Cela comprend l'induction enzymatique, l'inhibition des enzymes et les études de transporteur. Premièrement, lorsqu'un médicament agit comme un inducteur, il peut entraîner une expression accrue des enzymes et des transporteurs métabolisants. De forts inducteurs peuvent réguler à la hausse plusieurs gènes simultanément, tels que l'induction phénobarbitale de CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT et plusieurs protéines de transport comme MRP2. Deuxièmement, il existe des espèces - des différences spécifiques dans la façon dont les hépatocytes réagissent aux inducteurs. Par exemple, la rifampicine est un inducteur efficace pour les hépatocytes humains et lapin, mais n'a aucun effet d'induction sur les hépatocytes de rat. Enfin, la densité de placage sous-optimale des hépatocytes platables peut entraîner une réduction de l'expression basale des P450 et une augmentation artificiellement des réponses d'induction. Comme le montre la figure 3, les hépatocytes à des densités de placage plus faibles montrent une activité basale plus faible de CYP1A2, CYP2B6 et CYP3A4, mais des réponses d'induction plus fortes. Par conséquent, des hépatocytes sains à une densité de placage appropriée sont nécessaires pour obtenir des données physiologiquement pertinentes.

Figure 2. Relation entre la densité de placage des hépatocytes humains cryoconservés et l'induction des enzymes

Source: Current Drug Discovery Technologies, 2010, 7: 188 - 198

2). Évaluation de l'hépatotoxicité: Observer les changements morphologiques au microscope léger, tels que la morphologie cellulaire, l'agrégation de gouttelettes vacuole et lipidique, et attachement / détachement cellulaire. Détection de la nécrose des hépatocytes (comme indiqué par l'aspartate aminotransférase, la lactate déshydrogénase et l'alanine aminotransférase) et l'apoptose (fragmentation de l'ADN). Pour la cytotoxicité médiée par les cytokines -, des cultures monocouches uniques d'hépatocytes ne peuvent pas prédire les réponses toxiques dues à la régulation par des substances libérées des cellules non - parenchymateuses voisines, telles que les cellules Kupffer, les cellules Stellates et les cellules endothéliales sinusoïdales.

3). "Méthode de relais" pour l'étude de la clairance du composé de métabolisation lente et de ses métabolites: L'activité des enzymes de métabolisation des médicaments dans les hépatocytes plateaux commence à diminuer après 24 heures de placage. Après avoir incubé des hépatocytes plateaux avec du sérum - milieu libre contenant le composé d'intérêt pendant 24 heures, le milieu est collecté et mélangé, puis transféré à de nouveaux hépatocytes plateaux pour une étude plus approfondie (figure 3).

Figure 3. Processus de transfert de relais d'hépatocyte platepable

Source: Lettres de métabolisme des médicaments, 2016, 10: 3 - 15

3). Évaluer les effets d'absorption cellulaire, d'endocytose, d'évasion endosomale et de silençage sur le gène cible des médicaments d'acide nucléique ciblés.

Modèle de culture de sandwich

In vitro, les hépatocytes peuvent être cultivés entre deux couches de collagène ou de matrigel pour reconstruire des structures in vivo, connues sous le nom de culture de sandwich. Les hépatocytes cultivés entre deux couches de gel - collagène (structure sandwich) peuvent améliorer la morphologie et la viabilité des cellules et maintenir leur fonctionnalité pendant une période plus longue. De plus, les hépatocytes dans la culture des sandwichs peuvent restaurer la polarité, permettant une localisation appropriée des transporteurs basolatéraux et canaliculaires, ainsi que la formation de réseaux de canaux biliaires fonctionnels (figure 4).

Figure 4. Expression polarisée des transporteurs dans le modèle de sandwich aux hépatocytes humains

Source: Current Drug Discovery Technologies, 2010, 7, 188 - 198

Applications:

1. 1). Estimation de l'excrétion biliaire des composés.
2. 2). Évaluation de la distribution hépatique et biliaire des composés et métabolites endogènes et exogènes.
3. 3). Estimation de la clairance médiée par le métabolisme et les transporteurs et la construction de modèles pharmacocinétiques basés sur la physiologie -
4. 4). Étudier l'hépatotoxicité et fournir des mécanismes de médicament clinique - Blessure hépatique induite. Les données sont intégrées dans les modèles de pharmacologie des systèmes pour prédire les lésions hépatiques induites de médicaments potentiels chez l'homme.
5.  
   1. 3. Culture 3D des hépatocytes primaires

6. Dans les systèmes de culture 3D, les hépatocytes sont cultivés dans une matrice à trois dimensions, qui imite mieux l'architecture hépatique in vivo par rapport aux cultures monocouches 2D. Ces systèmes favorisent les interactions cellulaires et cellulaires et de cellules - matrice, qui peuvent restaurer davantage les fonctions physiologiques du foie, notamment le métabolisme des médicaments, la sécrétion de protéines et la formation de la bile. Les cultures 3D d'hépatocytes primaires peuvent être utilisées pour étudier les fonctions hépatiques - spécifiques dans un environnement plus in vivo, offrant des avantages pour les tests de médicaments, l'évaluation de la toxicité et la modélisation des maladies.

   Modèle sphéroïde

Grâce à des techniques telles que la culture d'attachement ultra - faible, la culture de drop suspendu et la culture des cellules magnétiques (figure 5), les hépatocytes primaires peuvent s'agréger en agrégats sphéroïdaux avec un diamètre allant jusqu'à 150 - 175 µm sans compter sur des matrices externes. Un avantage de la culture des sphéroïdes est que chaque sphéroïde ne nécessite que 1 330 - 2 000 cellules, réduisant considérablement le nombre de cellules par rapport aux autres techniques de culture 3D. Des études récentes ont montré que les cultures sphéroïdes des hépatocytes primaires peuvent maintenir jusqu'à 5 semaines, l'activité des enzymes CYP restant presque inchangée entre le jour 8 et le jour 35. L'analyse protéomique a révélé que, par rapport à la culture sandwich, les enzymes responsables de l'absorption des médicaments, de la distribution, du métabolisme et des excrétions sont mieux conservées pendant 14 jours dans la culture sphéroïde. Cependant, le foie est beaucoup plus complexe qu'un agrégat cellulaire. Le côté basolatéral des hépatocytes interagit avec le sang, tandis que la bile s'écoule du côté apical, qui est une caractéristique clé de la structure du lobule hépatique complexe, et cela ne peut pas encore être reproduit dans le modèle sphéroïde.

Applications:

1. 1). Étude de la clairance du composé de métabolisation lente et de ses métabolites.
2. 2). Recherche d'hépatotoxicité.
3. 3). Évaluation de l'absorption cellulaire, de l'endocytose, de l'évasion endosomale et des effets de silençage sur les gènes cibles des médicaments d'acide nucléique ciblés.

Figure 5. Méthode de culture des sphéroïdes

Modèle d'organeïdes hépatiques

La définition consensuelle des organoïdes est: les structures 3D dérivées de cellules souches, de cellules progénitrices ou de cellules différenciées, capables de reproduire certaines fonctions et structures du tissu natif in vitro, imitant efficacement le microenvironnement in vivo et les interactions cellulaires. Les organoïdes hépatiques ont été identifiés comme le modèle le plus avancé pour la recherche sur la biologie du foie humaine.

Sources cellulaires pour la construction organoïde du foie:

① Cellules souches pluripotentes (PSC):

Les cellules souches embryonnaires (ESC) et les cellules souches pluripotentes induites (IPSC) possèdent une pluripotence élevée, une plasticité et une capacité de prolifération illimitée. Sous l'influence de facteurs de signalisation spécifiques, ils se différencient en cellules d'hépatocyte - comme l'activité et la fonction. Cependant, les organoïdes hépatiques dérivés des PSC peuvent subir des altérations épigénétiques et génétiques, présentant des changements d'aneuploïdes chromosomiques pendant l'amplification.

Applications:

1. 1). Modèles génétiques des maladies du foie
2. 2). Modèles de maladie du foie infectieux
3. 3). Test de cytotoxicité médicamenteuse

② Tissu hépatique - cellules dérivées: celles-ci incluent les cholangiocytes et les hépatocytes. Les hépatocytes matures conservent le potentiel des cellules souches et la capacité de prolifération dans des environnements spécifiques. Par rapport aux organoïdes dérivés de PSC -, les organoïdes dérivés du tissu primaire sont plus matures, avec des génomes plus stables, et maintiennent la stabilité phénotypique et génétique pendant la longue culture in vitro. Cependant, la longue capacité de prolifération des organoïdes d'hépatocytes humains matures est limitée par rapport aux hépatocytes humains fœtaux ou aux hépatocytes primaires de souris adultes. La culture des organoïdes d'hépatocytes adultes reste difficile.

Méthode de culture (Figure 6): Le tissu hépatique est digéré en cellules uniques, et un mélange de matrigel et de cellules est ensemencé dans une plaque de 24 - puits pour former des structures en forme de dôme. Incuber dans un incubateur de culture cellulaire (37 ° C) pendant 15 minutes. Après la solidification, ajoutez un milieu de culture spécifique. Passage après environ 14 jours. Remplacez le milieu d'origine par un milieu de différenciation après 7 - 10 jours.

Applications:

1. 1). Modèles d'hépatotoxicité
2. 2). Études de troubles du métabolisme in vitro
3. 3). Maladie hépatique non - alcoolique
4. 4). Développement de médicaments pour les maladies hépatiques bénignes et malignes

Figure 6. Culture et processus de passage des organes hépatiques dérivés

Source: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

Comparaison de la culture des sphéroïdes et de la culture organoïde

4. Modèle de culture d'hépatocytes primaires

1. 1. Modèle de culture d'hépatocyte primaire 2d
      

      Dans le modèle de culture d'hépatocytes primaires 2D, deux types de cellules ou plus sont mixtes et cultivés dans un environnement à deux - dimensions. La caractéristique clé de ce modèle est l'interaction directe entre les différents types de cellules, l'interaction entre les cellules et la matrice extracellulaire, ou la transmission du signal indirect via les cytokines et les communications chimiques. Les fonctions primaires des hépatocytes, telles que la production d'albumine et la capacité du métabolisme des médicaments, peuvent être maintenues jusqu'à trois semaines.

      Applications:

      1. 1). Hépatocytes primaires co - cultivés avec des fibroblastes: ce modèle est utilisé pour étudier le taux de clairance des composés lents - métabolisants et leurs métabolites.
      2. 2). Les hépatocytes primaires sont cultivés avec des cellules hépatiques non parenchymateuses (par exemple, les cellules stellées, les cellules endothéliales sinusoïdales): ce modèle est utile pour rechercher un médicament induit - une lésion hépatique induite (DILI), car elle aide à étudier le rôle des cytokines, des chimiokines et des facteurs de croissance dans les réponses adaptatives modulantes après l'exposition médicamenteuse.
      3. 3). Hépatocytes primaires co - cultivés avec les cellules T: ce modèle est utilisé pour détecter le métabolisme du médicament hépatique - Réponses spécifiques des lymphocytes T.
      4. 4). Hepatomax ™ d'IphaseCO - SYSTÈME DE CULTURE: iphase a développé un système de culture co - avec des hépatocytes primaires de différentes espèces, connues sous le nom d'hépatomax™. En cultivant des hépatocytes primaires humains avec des cellules stromales, il est possible de maintenir un bon médicament - Métaboliser l'activité des enzymes dans les hépatocytes humains pendant jusqu'à 3 semaines. Ce système convient pour étudier lent - métaboliser les taux de dégagement des composés et leurs métabolites.

      Ce modèle de culture fournit une plate-forme plus physiologiquement pertinente pour évaluer le métabolisme des médicaments, la toxicité et les processus pathologiques du foie, offrant des informations sur la façon dont différents types de cellules contribuent à la fonction hépatique et à la maladie.
      
      

      Modèle de culture d'hépatocytes primaires 3D

      Culture 3D directe: Ce modèle consiste à mélanger deux ou plusieurs types de cellules hépatiques ou plus (par exemple, des hépatocytes primaires, des cellules endothéliales sinusoïdales, des cellules stellées hépatiques, des cellules Kupffer) pour former des sphéroïdes auto-assemblés ou des co - la culture dans un environnement 3D construit avec des matériaux tels que la collagène, la fibrine, l'alginate ou les hydrogels. La culture 3D directe permet une interaction étroite entre différentes cellules hépatiques à travers des mécanismes comme la cellule - à l'adhésion cellulaire, la signalisation paracrine via des cytokines solubles et l'adhésion de la matrice extracellulaire, permettant une communication entre les hépatocytes.

      Applications:

      1. 1). Modèle de fibrose hépatique: utilisé pour étudier les mécanismes et la progression de la fibrose hépatique.
      2. 2). Modèle de drogue - Modèle de lésions hépatiques induits (DILI): Aide à simuler et à évaluer les dommages hépatiques causés par les médicaments.
      3. 3). Interactions médicamenteuses, métabolisme des médicaments et induction enzymatique: évalue comment les différents médicaments interagissent, comment ils sont métabolisés et comment ils induisent des enzymes hépatiques.

      Culture 3D indirecte: Cette méthode utilise un système de séparation physique (par exemple, Transwell ou d'autres matériaux) pour cultiver deux types de cellules ou plus (tels que les hépatocytes primaires avec des cellules NIH / 3T3 ou des cellules endothéliales sinusoïdales) dans un environnement 3D, où la cellule directe - à - Le contact cellulaire est empêché. La communication entre les cellules se produit via des cytokines solubles.

      Applications:
      Utilisé pour étudier la communication sans contact entre les cellules hépatiques du corps.

      
      En résumé, l'iPhase, en tant que leader de la recherche biologique in vitro, fournit des solutions complètes pour les tests de médicaments non cliniques. De l'isolement et de la culture des hépatocytes primaires de diverses espèces au développement de produits de support tels que les milieux de culture pour des applications spécifiques ou des plaques de collagène multi-spécification, l'iphase est consacrée à offrir les meilleurs outils de recherche in vitro pour la découverte et le développement de médicaments. Nous sommes un partenaire de confiance pour les clients de l'industrie pharmaceutique, engagés à fournir des solutions de coupe - Edge pour la recherche non clinique.