Hepatocytes Bunscoile: uirlis ríthábhachtach chun taighde drugaí in vitro cliniciúil a chur chun cinn

Hepatocytes Bunscoile: uirlis ríthábhachtach chun taighde drugaí in vitro cliniciúil a chur chun cinn

Tá ról ríthábhachtach ag an ae, mar an phríomh -orgán le haghaidh nochtadh drugaí, i meitibileacht drugaí agus i bpróisis tocsaineachta. Tá an speictream iomlán de thréithe ceallacha agus leibhéil fhiseolaíocha einsímí agus cónraí ag hepatocytes príomhúil, lena n -áirítear einsímí ceangailte membrane - einsímí ceangailte mar cytochrome P450 (measctha - oxidase feidhme sa reticulum endoplasmic réidh) agus esterases cytosolic, cuimsíonn siad na conairí meitibólacha go léir a aimsítear sa léas. Ar an gcúis seo, meastar go forleathan go bhfuil hepatocytes príomhúil mar an caighdeán óir chun samhlacha ae in vitro a thógáil agus is fearr le taighdeoirí iad idirghníomhaíocht drugaí, meitibileacht drugaí, agus staidéir tocsaineachta. Tugann an t -alt seo forbhreathnú ar mhúnlaí cultúir 2D agus 3D bunaithe ar hepatocytes príomhúil agus a n -iarratais ar fhorbairt drugaí.

Eochairfhocail: Hepatocytes príomhúil, saothrú 2D, saothrú 3D, orgáinsí, Cultúr.

1. Leithlisiú na bpríomh -hepatocytes

Is céim chriticiúil é leithlisiú hepatocytes príomhúil chun samhlacha ae in vitro a bhunú, agus is é an modh perfusion collagenase dhá chéim an ceann is coitianta a úsáidtear. In ainmhithe níos lú, is féidir an t -ae a dhéanamh tríd an bhféith thairseach nó tríd an gcava vena níos ísle, agus is iondúil go n -éilíonn ainmhithe níos mó perfusion trí lobes nó deighleoga ae. Bíonn tionchar ag roinnt príomhfhachtóirí ar leithlisiú rathúil hepatocytes: ar dtús, ba chóir go mbeadh collagenase neamh -chíteatocsaineach. Ar an dara dul síos, tá uainiú an díleá ríthábhachtach—Is féidir le díleá agus níos mó ná díleá araon toradh agus inmharthanacht hepatocyte a chomhréiteach. Ar an tríú dul síos, ní mór an coinníoll ae a bheith optamach, mar go bhfuil hepatocytes an -íogair do dhamáiste ischemic. Ba chóir an t -ae a úsáidtear le haghaidh ullmhúchán hepatocyte a fhuarú go tapa chun rátaí meitibileacha a laghdú agus chun hypoxia meitibileach agus ischemia ina dhiaidh sin a chosc.

Is iad seo a leanas na caighdeáin do phríomh -hepatocytes a úsáidtear i dtaighde drugaí:

1. 2. Cultúr Hepatocyte Bunscoile

An tsamhail Hepatocyte Fionraí

Tá druga iomlán ann - einsímí agus cónraí meitibiliúcháin, rud a chiallaíonn go bhfuil sé oiriúnach chun staidéar a dhéanamh ar chosáin imréitigh meitibileacha éagsúla. Mar sin féin, laghdaíonn inmharthanacht hepatocytes fionraí agus gníomhaíocht na n -einsímí meitibiliúcháin de réir a chéile de réir mar a mhéadaíonn an t -am goir in vitro, rud a chuireann teorainn leis an am goir go dtí uasmhéid 4 uair an chloig. Is iondúil go n -úsáidtear an tsamhail seo chun imréiteach drugaí a mheas le rátaí imréitigh measartha go hard. Nuair a bhíonn an ráta imréitigh níos lú ná 20%, ní féidir luachanna cruinn imréitigh a chinneadh. Ní leor na samhlacha meitibileachta in vitro bunaithe ar fhionraí traidisiúnta chun imoibrithe meitibileacha inbhraite a ghiniúint le haghaidh comhdhúile meitibiliúcháin mall, rud a chuireann srian ar a gcumas na rátaí imréitigh agus táirgí meitibileacha na gcomhdhúl seo a thuar. Is féidir modh sealaíochta hepatocyte fionraí (Figiúr 1) a úsáid chun an t -am goir a leathnú go 20 uair an chloig nó níos faide.

Iarratas:Gníomhaíocht einsím agus staidéir chobhsaíochta meitibileach do dhrugaí móilíní beaga.

Figiúr 1. Próiseas aistrithe modh sealaíochta hepatocyte fionraí

Foinse: Drugaí Drugaí Diúscartha, 2012,40 (9): 1860–1865

An tsamhail hepatocytes platible

Tá hepatocytes príomhúil saothraithe i gcóras 2D ar phlátaí cultúir brataithe. Taispeánann na hepatocytes moirfeolaíocht epithelial, le núicléis atá ag dul i léig, a chuirtear i láthair go minic i bhfoirm binucleated. I measc na míbhuntáistí a bhaineann le cultúr monolayer hepatocyte aonair tá: 1. athrú ar pholaraíocht cille agus feidhm.2. Easpa cineálacha cille ábhartha eile (i.e., cealla neamh -pharenchymal) atá ag teastáil le haghaidh gnáthfheidhm.3. Neamhábaltacht cothaithigh agus fachtóirí paracrine leordhóthanacha a sholáthar chun tacú leis na hepatocytes maidir lena bhfeidhmeanna a chomhlíonadh (mar shampla aigéad bile agus biosynthesis próitéine serum).

Iarratais:

1). Meastóireacht ar dhrugaí - idirghníomhaíochtaí drugaí:Áirítear leis seo ionduchtú einsím, toirmeasc ar einsím, agus staidéir iompróra. Ar an gcéad dul síos, nuair a fheidhmíonn druga mar ionduchtóir, is féidir go mbeidh léiriú méadaithe drugaí ann - einsímí meitibiliúcháin agus iompróirí. Is féidir le hionadaitheoirí láidre géinte iomadúla a ghéarú ag an am céanna, mar shampla ionduchtú feinobarbital CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT, agus roinnt próitéiní iompair ar nós MRP2. Ar an dara dul síos, tá speicis ann - difríochtaí sonracha maidir leis an gcaoi a bhfreagraíonn hepatocytes do dhaoine a bhíonn ag teacht chun cinn. Mar shampla, is ionduchtóir éifeachtach é Rifampicin do hepatocytes daonna agus coinín, ach níl aon éifeacht ionduchtaithe aige ar hepatocytes francach. Mar fhocal scoir, d'fhéadfadh dlús plating fo -optamach hepatocytes platible a bheith mar thoradh ar léiriú basal laghdaithe P450S agus freagraí ionduchtaithe méadaithe go saorga. Mar a léirítear i bhFigiúr 3, léiríonn hepatocytes ag dlúis plating níos ísle gníomhaíocht basal níos ísle de CYP1A2, CYP2B6, agus CYP3A4, ach freagraí ionduchtaithe níos láidre. Dá bhrí sin, tá gá le hepatocytes sláintiúil ag dlús plating cuí chun sonraí atá ábhartha ó thaobh na fiseolaíochta de a fháil.

Figiúr 2. Gaol idir dlús plating hepatocytes daonna agus ionduchtú einsíme

Foinse: Teicneolaíochtaí Drugaí Drugaí Reatha, 2010, 7: 188 - 198

2). Measúnú Hepatotoxicity. Brath neacróis hepatocyte (mar atá léirithe ag aminotransferase aspartate, dehydrogenase lachtáit, agus aminotransferase alanine) agus apoptosis (ilroinnt DNA). Maidir le cytokine - cíteatocsaineacht idirghabhála, ní féidir le cultúir monolayer aonair de hepatocytes freagairtí tocsaineacha a thuar mar gheall ar an rialachán trí shubstaintí a scaoiltear ó chealla neamh -pharenchymal comharsanacha, amhail cealla kupffer, cealla stellate, agus cealla endothelial sinusóideach.

3). "Modh sealaíochta" chun staidéar a dhéanamh ar imréiteach cumaisc meitibiliú mall agus a mheitibilítí. Tar éis hepatocytes platible a ghoradh le serum - meán saor in aisce ina bhfuil an comhdhúil spéise ar feadh 24 uair an chloig, bailítear agus meascadh an meán, ansin aistrítear é go hepatocytes nua platible le haghaidh tuilleadh staidéir (Figiúr 3).

Figiúr 3.

Foinse: Litreacha Meitibileachta Drugaí, 2016, 10: 3 - 15

3). Déan meastóireacht ar an nglacadh ceallach, ar an endocytosis, ar an éalú endosomal, agus ar na héifeachtaí tosta ar an sprioc -ghéin de hepatocyte - drugaí beag aigéid núicléasaigh spriocdhírithe.

Múnla Saothrú Ceapaire

In vitro, is féidir hepatocytes a shaothrú idir dhá shraith de collagen nó matrigel chun struchtúir in vivo a athchruthú, ar a dtugtar saothrú ceapaire. Is féidir le hepatocytes atá saothraithe idir dhá shraith glóthach - collagen (struchtúr ceapaire) moirfeolaíocht agus inmharthanacht na gceall a fheabhsú, agus a bhfeidhmiúlacht a choinneáil ar feadh tréimhse níos faide. Ina theannta sin, is féidir le hepatocytes i gcultúr ceapaire polaraíocht a athbhunú, rud a cheadaíonn logánú cuí iompróirí basolateral agus canálach, chomh maith le líonraí duct bile feidhme a fhoirmiú (Figiúr 4).

Figiúr 4. Léiriú polaraithe iompróirí sa mhúnla ceapaire hepatocyte daonna

Foinse: Teicneolaíochtaí Drugaí Drugaí Reatha, 2010, 7, 188 - 198

Iarratais:

1. 1). Eisfhearadh biliary de chomhdhúile a mheas.
2. 2). Measúnú a dhéanamh ar dháileadh hepatic agus biliary comhdhúile agus meitibilítí endogenous agus exogenous.
3. 3). Meastachán a dhéanamh ar imréiteach arna idirghabháil ag meitibileacht agus iompróirí, agus ag tógáil samhlacha cógaschinéiteacha bunaithe ar fhiseolaíocht.
4. 4). Staidéar a dhéanamh ar thocsaineacht agus ar mheicníochtaí a sholáthar do dhrugaí cliniciúla - gortú ae spreagtha. Déantar sonraí a chomhtháthú le samhlacha cógaseolaíochta córais chun gortú féideartha drugaí a thuar i ndaoine.
5.  
   1. 3.

6. I gcórais chultúir 3D, déantar hepatocytes a shaothrú i maitrís tríthoiseach, a dhéanann aithris níos fearr ar ailtireacht ae in vivo i gcomparáid le cultúir 2D monolayer. Cuireann na córais seo chun cinn idirghníomhaíochtaí cille agus cille - cille - Is féidir úsáid a bhaint as cultúir 3D hepatocyte príomhúla chun staidéar a dhéanamh ar fheidhmeanna ae - i dtimpeallacht níos mó in vivo -

   Samhail sféaróideach

Trí theicnící amhail cultúr astaíochtaí íseal, cultúr titim crochta, agus cultúr na gceall maighnéadach (Figiúr 5), is féidir le hepatocytes príomhúla comhiomlán a chomhiomlánú i gcomhiomláin spheroidal le trastomhas suas le 150 - 175 µm gan a bheith ag brath ar mhaitrísí seachtracha. Buntáiste amháin a bhaineann le cultúr spheroid ná nach n -éilíonn gach spheroid ach 1,330 - 2,000 ceall, rud a laghdaíonn go mór líon na gceall i gcomparáid le teicnící cultúir 3D eile. Tá sé léirithe ag staidéir a rinneadh le déanaí gur féidir le cultúir sphepatocyte príomhúla a chothú ar feadh suas le 5 seachtaine, agus léirigh gníomhaíocht einsím CYP beagnach gan athrú idir lá 8 agus lá 35. Mar sin féin, tá an t -ae i bhfad níos casta ná an comhiomlán cille. Idirghníomhaíonn an taobh basolateral de hepatocytes le fuil, agus sreabhann bile amach as an taobh apical, atá ina phríomhghné den struchtúr coimpléasc ae, agus ní féidir é seo a mhacasamhlú go fóill sa mhúnla spheroid.

Iarratais:

1. 1). Staidéar ar imréiteach cumaisc meitibiliú mall agus a mheitibilítí.
2. 2). Taighde Hepatotoxicity.
3. 3). Meastóireacht ar ghlacadh ceallach, endocytosis, éalú endosomal, agus éifeachtaí tosta ar sprioc -ghéinte hepatocyte - drugaí beag aigéid núicléasaigh spriocdhírithe.

Figiúr 5. Modh Cultúir Spheroid

Múnla orgánach ae

Is é an sainmhíniú comhdhearcaidh ar orgánaigh ná: struchtúir 3D a dhíorthaítear ó gaschealla, cealla progenitor, nó cealla difreáilte, atá in ann feidhmeanna agus struchtúir áirithe a atáirgeadh in vitro fíochán dúchais a atáirgeadh, ag mimicking go héifeachtach an micro -chomhshaol in vivo agus na hidirghníomhaíochtaí cille go - Aithníodh orgánach ae mar an tsamhail is úire do thaighde bitheolaíochta ae an duine.

Foinsí cealla le haghaidh tógáil orgánach ae:

① Gaschealla Pluripotent (PSCanna):

Tá gaschealla, plaisteacht agus cumas iomadúil neamhtheoranta ag gaschealla suthacha (ESCanna) agus gaschealla pluripotent spreagtha (IPSCanna). Faoi thionchar na bhfachtóirí comharthaíochta sonracha, déanann siad idirdhealú idir hepatocyte - cosúil le cealla le gníomhaíocht agus feidhm. Mar sin féin, is féidir le horgáin ae a dhíorthaítear ó PSCanna athruithe epigenetic agus géiniteacha a dhéanamh, ag taispeáint athruithe aneuploidy crómasóim le linn aimplithe.

Iarratais:

1. 1). Múnlaí galar ae géiniteach
2. 2). Múnlaí tógálacha galar ae ae
3. 3). Tástáil cíteatocsaineachta drugaí

② Fíochán ae - Cealla díorthaithe: áirítear orthu seo cholangiocytes agus hepatocytes. Coinníonn hepatocytes aibí poitéinseal gascheall agus cumas iomadúil i dtimpeallachtaí sonracha. I gcomparáid le PSC - orgánach díorthaithe, tá orgáin a dhíorthaítear ó fhíochán príomhúil níos aibí, le géanóim níos cobhsaí, agus cothaíonn siad cobhsaíocht feinitíopach agus géiniteach le linn cultúr fadtéarmach in vitro. Mar sin féin, tá an téarma fadtréimhseach de chumas iomadúil na n -orgánach aibí hepatocyte daonna teoranta i gcomparáid le hepatocytes daonna féatais nó hepatocytes bunscoile do dhaoine fásta. Tá dúshlán fós ag baint le horgáin hepatocyte do dhaoine fásta.

Modh Cultúir (Figiúr 6): Déantar fíochán ae a dhíleá i gcealla aonair, agus déantar meascán de mhatrigel agus de chealla a shíolú i bpláta tobann chun struchtúir chruthach a dhéanamh. Goir i ngorlann cultúir cille (37 ° C) ar feadh 15 nóiméad. Tar éis soladú, cuir meán cultúir ar leith leis. Pasáiste tar éis thart ar 14 lá. Cuir meán difreála in ionad an mheáin bhunaidh tar éis 7 - 10 lá.

Iarratais:

1. 1). Múnlaí Hepatotoxicity
2. 2). Staidéir neamhord meitibileachta in vitro
3. 3). Galar ae saille alcólach neamh -
4. 4). Forbairt drugaí do ghalair ae neamhurchóideacha agus urchóideacha

Figiúr 6. Próiseas Cultúir agus Pasáiste Fíochán - Organóidí Ae Díorthaithe

Foinse: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

Comparáid idir cultúr spheroid agus cultúr orgánach

4. Samhail Cultúir Hepatocyte Bunscoile

1. 1. 2d Bunscoile Hepatocyte CO - Múnla Cultúir
      

      Sa mhúnla cultúir 2D Hepatocyte Com cultúir, tá dhá chineál cille éagsúla measctha agus saothraithe i dtimpeallacht dháthoiseach. Is í príomhghné na samhla seo an t -idirghníomhaíocht dhíreach idir cineálacha éagsúla cille, an idirghníomhaíocht idir cealla agus an mhaitrís eisilteach, nó an tarchur comhartha indíreach trí chíteatónna agus cumarsáid cheimiceach. Is féidir feidhmeanna príomhúla hepatocyte, amhail táirgeadh albaimin agus cumas meitibileachta drugaí, a choinneáil ar feadh suas le trí seachtaine.

      Iarratais:

      1. 1). Hepatocytes príomhúil Cothaigh le fibroblasts: Úsáidtear an tsamhail seo chun staidéar a dhéanamh ar an ráta imréitigh de chomhdhúile meitibiliúcháin agus a meitibilítí.
      2. 2). Hepatocytes príomhúil a shaothrú le cealla ae neamh -pharenchymal (m.sh., cealla stellate, cealla endothelial sinusóideach): Tá an tsamhail seo úsáideach chun taighde a dhéanamh ar dhrugaí a tharlódh (DILI), mar go gcabhraíonn sé le cytokines, ceimiceáin, agus fachtóirí fáis a imscrúdú i bhfreagraí oiriúnaithe an ae.
      3. 3). Hepatocytes príomhúil Cothaitheach le cealla T: Úsáidtear an tsamhail seo chun meitibileacht drugaí ae a bhrath - Freagraí sonracha T cille.
      4. 4). Hepatomax ™ iPhaseCóras Cultúir CO - Tá córas cultúir forbartha ag iPhase le hepatocytes príomhúil ó speicis éagsúla, ar a dtugtar hepatomax™. De réir hepatocytes bunscoile daonna a shaothrú le cealla stromal, is féidir druga maith a choinneáil - gníomhaíocht einsím a mheitibiliú i hepatocytes daonna ar feadh suas le 3 seachtaine. Tá an córas seo oiriúnach chun staidéar a dhéanamh ar rátaí imréitigh cumaisc mall - meitibiliú agus a meitibilítí.

      Soláthraíonn an tsamhail chultúir seo ardán níos ábhartha ó thaobh na fiseolaíochta de chun measúnú a dhéanamh ar mheitibileacht drugaí, ar thocsaineacht, agus ar phróisis galair ghaolmhara, ag tairiscint léargas ar an gcaoi a gcuireann cineálacha difriúla cille le feidhm agus galar ae.
      
      

      Samhail Cultúir 3D Hepatocyte Bunscoile 3D

      CUNT 3D Direct 3D - Cultúr: Is éard atá i gceist leis an tsamhail seo ná dhá chineál éagsúla nó níos mó de chealla ae a mheascadh (m.sh., hepatocytes príomhúil, cealla endothelial sinusóideach, cealla stellate hepatic, cealla kupffer) chun féin -spheroids cóimeáilte a chruthú nó iad a shaothrú i dtimpeallacht 3D a tógadh le hábhair mar collagen, snáithín, ailgin, nó hydrogels. Ceadaíonn an cultúr 3D díreach idirghníomhaíocht dhlúth idir cealla éagsúla ae trí mheicníochtaí cosúil le cille - go - greamaitheacht cille, comharthaíocht paracrine trí chíteatónna intuaslagtha, agus greamaitheacht maitríse extracellular, cumarsáid a chumasú idir hepatocytes.

      Iarratais:

      1. 1). Múnla fiobróis ae: a úsáidtear chun staidéar a dhéanamh ar mheicníochtaí agus ar dhul chun cinn fiobróis ae.
      2. 2). Drugaí - Múnla Gortú Ae (DILI) spreagtha: Cabhraíonn sé le damáiste ae a ionsamhlú agus a mheas de bharr drugaí.
      3. 3). Idirghníomhaíochtaí drugaí, meitibileacht drugaí, agus ionduchtú einsím: déanann sé meastóireacht ar an gcaoi a n -idirghníomhaíonn drugaí difriúla, conas a dhéantar iad a mheitibiliú, agus conas a spreagann siad einsímí ae.

      CO 3D indíreach 3D - Cultúr. Tarlaíonn an chumarsáid idir na cealla trí chíteatóin intuaslagtha.

      Iarratais:
      Úsáidte chun staidéar a dhéanamh ar chumarsáid neamh - teagmhála idir cealla ae sa chorp.

      
      Go hachomair, soláthraíonn iPhase, mar cheannaire i dtaighde bitheolaíoch in vitro, réitigh chuimsitheacha do thástáil drugaí cliniciúla. Ó aonrú agus ó chultúr hepatocytes príomhúil ó speicis éagsúla go dtí forbairt táirgí tacaíochta mar mheáin chultúir le haghaidh feidhmchlár sonrach nó collagen sonraíochta - Plátaí brataithe, tá iPhase tiomanta do na huirlisí taighde in vitro is fearr a thairiscint le haghaidh fionnachtain agus forbairt drugaí. Is comhpháirtí iontaofa muid do chliaint sa tionscal cógaisíochta, atá tiomanta do réitigh gearrtha a sholáthar do thaighde cliniciúil.