Fracción de fígado de rata inducida: un sistema de activación metabólica para probas de xenotoxicidade e mutación in vitro

Palabras clave: OCDE 471, OCDE 473, OCDE 476, OCDE 487, proba de mutación, xenotoxicidade, toxicidade xenética, fígado de rata inducido S9, proba de Ames, Mini Ames Test, Aberration cromosómico, Micronucleus, HPRT/HGPRT ANAE, TK ensaio

Produto IPHase

Introdución

Fígado de rata inducidoé un compoñente clave para avaliar oToxicidade xenéticaPotencial de produtos químicos, especialmente na toxicoloxía reguladora. Úsase comunmente en combinación con ensaios in vitro, como oProba de ames eProbas de mutación, para avaliar as propiedades mutaxénicas dos compostos. Ao proporcionar un sistema enzimático rico en citocromo P450 (CYP450), a fracción de fígado de rata inducida xoga un papel crucial na simulación dos procesos metabólicos que se producen no fígado, axudando a determinar se os produtos químicos poden causar mutacións xenéticas ou cancro.

Fígado de rata inducido

A fracción do fígado S9 refírese a un sobrenadante mitocondrial obtido dos homoxeneados do fígado de rata despois dunha serie de pasos de centrifugación. O termo "inducido" refírese ao tratamento de ratas con compostos específicos que aumentan a actividade dos encimas hepáticos, particularmente os encimas citocromo P450 (CYP450), que son responsables do metabolismo dunha ampla gama de xenobióticos.

A fracción de fígado de rata inducida contén unha variedade de encimas implicadas no metabolismo da fase I e da fase II de produtos químicos. Isto inclúe encimas como as monooxixenases do citocromo P450, que facilitan a biotransformación oxidativa de substratos, imitando así o metabolismo do fígado humano.

Actividade CYP450 e activación metabólica

A familia citocromo P450 encimática (CYP450) xoga un papel fundamental no metabolismo dunha gran variedade de substancias, incluíndo moitos farmacéuticos, produtos químicos ambientais e canceríxenos. A fracción de fígado de rata inducida contén estes encimas e é esencial para avaliar produtos químicos que só poden converterse en xenotóxicos despois da activación metabólica.

Moitos compostos son inicialmente non - tóxicos pero poden converterse en tóxicos despois do metabolismo no fígado. Estes pro - mutáxenos (que requiren que a activación metabólica se converta mutaxénica) e pro - canceríxenos (que requiren activación para causar cancro) só se poden detectar a través de ensaios que inclúen un sistema de activación metabólica S9. Sen a indución de encimas metabólicas como CYP450, estas substancias poden parecer inofensivas nas probas de xenotoxicidade estándar.

Ao engadir ensaios de fígado de rata inducidos a ensaios in vitro, os investigadores poden avaliar como unha sustancia interactúa cos encimas CYP450. Isto é particularmente importante para os farmacéuticos, xa que o metabolismo das enzimas CYP450 é un paso crítico na farmacocinética de moitos fármacos.

Aplicacións do fígado de rata inducido

1. 1. Proba de Ames (OCDE 471)

A proba de Ames, descrita na directrizOCDE 471, é un dos métodos máis ben coñecidos e moi empregados para avaliar a mutaxenicidade. Implica expoñer cepas de bacterias de Salmonella a un produto químico para ver se induce mutacións que fan que a bacteria volva a unha histidina - estado independente.

Para simular o proceso metabólico humano, a miúdo engádese o fígado de rata inducido ao sistema de proba. A fracción S9 proporciona as enzimas necesarias, incluído o CYP450, que poden ser necesarias para metabolizar o composto nunha forma máis reactiva que poida causar mutacións no ADN bacteriano. Esta combinación de S9 coa proba de Ames permite unha avaliación máis completa do potencial mutaxénico imitando mecanismos mutaxénicos tanto directos como metabolicamente activados.

2. 2.Probas de mutación (proba de aberración cromosómica, proba de micronúcleo e outros ensaios in vitro)

Ademais da proba de Ames, as probas de mutación úsanse normalmente para avaliar o potencial xenotóxico dos produtos químicos. Estas probas son máis completas para avaliar unha serie de danos xenéticos, incluíndo mutacións cromosómicas, mutacións xénicas e formación de micronúcleos. O fígado de rata inducido S9 úsase nas probas de mutación polos seguintes motivos:

Proba de micronúcleo (OCDE 487)

Esta proba detecta a formación de micronúcleos en células, que son pequenos corpos extranucleares que conteñen fragmentos de cromosomas ou cromosomas enteiros que non se incorporaron ao núcleo durante a división celular. O proba de micronúcleopode detectar efectos clastogénicos (cromosoma - rotura) e aneugénicos (que afectan ao número de cromosomas). O fígado de rata inducido úsase aquí para activar a sustancia de proba metabolicamente, xa que algúns produtos químicos só causan danos cromosómicos unha vez que foron metabolizados por encimas hepáticas. A fracción S9 mellora a sensibilidade da proba simulando a activación metabólica que pode ocorrer in vivo.

Proba de aberración cromosómica (OCDE 473)

Esta proba avalía se unha sustancia pode causar danos estruturais nos cromosomas inducindo roturas, eliminacións, translocacións ou outro tipo de aberracións. Como a proba de micronúcleo, oProba de aberración cromosómicapódese aplicar con ou sen activación metabólica. O fígado de rata inducido S9 engádese ao sistema de proba para imitar os procesos metabólicos no fígado, permitindo a avaliación de substancias que poden non causar danos cromosómicos na súa forma orixinal pero poderían facelo despois do metabolismo do fígado.

Táboa 1. Consideracións comparativas das probas de mutación

Ensaio HPRT/HGPRT (OCDE 476)

NoEnsaio HPRT/HGPRT, As culturas de hámster chinés (CHO ou V79) ou as células linfoblastoides humanas (TK6) están expostas ao produto químico de proba en presenza dunha mestura metabólica do fígado de rata inducida, que subministra encimas CYP450 necesarias para converter pro -mutágenos en especies reaccionadas con ADN. Despois dun breve tratamento e un período de expresión de sete días, as células son desafiadas con 6 -tioguanina; Só sobreviven os clons que levan mutacións de perda de función no xene hipoxantina -guanina fosforibosiltransferase sobreviven. Ao comparar a colonia mutante conta coa viabilidade global, os investigadores determinan unha frecuencia de mutación que, se se eleva reproduciblemente nos controis concorrentes e históricos, indica un potencial xenotóxico.

Ensaios TK (OCDE 490 & OCDE 476)

OEnsaio TK Emprega células de linfoma de rato L5178Y (OCDE 490) ou células CHO (OCDE 476) Heterozigoto deseñado no lugar da timidina quinasa. Despois da exposición química ± S9 Mix, as células recuperan e están placas en medio que conteñen trifluorotimidina, que mata células propias de TK. Os mutantes de TK⁻ sobreviventes forman colonias durante 10-14 días, con mutantes de pequena colonia a miúdo reflectindo eventos cromosómicos e mutantes de gran colonia que reflicten as mutacións do punto. Do mesmo xeito que no ensaio HPRT/HGPRT, os controis de citotoxicidade rigorosos e os referentes de mutageno positivos garanten que os aumentos observados na frecuencia de mutación reflicten de forma fiable o risco xenotóxico dun composto.

4. 4. Avaliación do risco de cancro

O fígado de rata inducido S9 tamén se usa en estudos dirixidos a avaliar o cancro - causando potencial de substancias. Ao simular os procesos metabólicos que se producen no fígado humano, a fracción S9 pode axudar a identificar compostos que poidan levar á formación de metabolitos reactivos capaces de unirse ao ADN e causar mutacións que poidan levar ao cancro.

Proba de Ames mellorada con hígado de hámster inducido

Segundo as últimas directrices emitidas pola Axencia Europea de Medicamentos (EMA), a proba tradicional de Ames pode non ser o suficientemente sensible como para detectar o potencial mutagénico de certas impurezas de nitrosamina, especialmente n - nitrosodimetilamina (NDMA), entre outras. Polo tanto, a proba de Ames mellorada, desenvolvida polo Centro Nacional de Investigación Toxicolóxica (NCTR), unha división da Administración de alimentos e drogas dos Estados Unidos (FDA), foi recomendada como unha alternativa máis fiable. A proba de Ames mellorada introduciu a adición de fígado de hámster inducido S9, que se realizou en conter un 30% de fígado de rata S9 e un 30% de fígado de hámster S9. Os sobrenadantes desmosómicos de rata e hámster deben prepararse a partir de fígados de roedores tratados con enzima citocromo P450 - Substancias inducidas. Ao usar o fígado de hámster inducido S9, esta proba mellorada simula mellor o metabolismo humano e aumenta a fiabilidade dos resultados.

Conclusión

O fígado de rata inducido S9 serve como ferramenta crítica nas probas de xenotoxicidade, axudando aos investigadores e ás axencias reguladoras a avaliar o potencial mutaxénico e canceríxeno dos produtos químicos. Ao proporcionar un sistema de activación metabólica, aumenta a capacidade de ensaios como a proba de Ames, probas de mutación e estudos de actividade CYP450 para detectar substancias que requiren que a activación metabólica sexa xenotóxica. As súas aplicacións son esenciais para garantir a seguridade de novos medicamentos, produtos químicos e produtos de consumo. Co seu papel na simulación do metabolismo do fígado humano, a fracción inducida do fígado de rata S9 segue a ser unha parte indispensable da toxicoloxía moderna e das avaliacións de seguridade reguladora.