Inducirana frakcija jetre štakora S9: sustav metaboličke aktivacije za in vitro genotoksičnost i mutacijske testove

Ključne riječi: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, Test mutacije, genotoksičnost, genetska toksičnost, inducirana jetra štakora S9, test AMES, Mini Ames test, kromosomska aberacija, Mikronukleus, HPRT/HGPRT ASTAY, TK ASTAY

Ifazni proizvod

Uvod

Inducirana jetra štakora S9je ključna komponenta u procjenigenetska toksičnostPotencijal kemikalija, posebno u regulatornoj toksikologiji. Obično se koristi u kombinaciji s in vitro testovima, poputAmes test iMutacijski testovi, za procjenu mutagenih svojstava spojeva. Davanjem enzimski sustav bogat citokromom P450 (CYP450), inducirana frakcija jetre štakora S9 igra ključnu ulogu u simulaciji metaboličkih procesa koji se javljaju u jetri, pomažući u utvrđivanju mogu li kemikalije potencijalno uzrokovati genetske mutacije ili rak.

Inducirana jetra štakora S9

Frakcija jetre S9 odnosi se na post - mitohondrijski supernatant dobiven iz homogenata jetre štakora nakon niza koraka centrifugiranja. Izraz "induciran" odnosi se na liječenje štakora s specifičnim spojevima koji pojačavaju aktivnost enzima jetre, posebno enzima citokroma P450 (CYP450), koji su odgovorni za metabolizam širokog raspona ksenobiotika.

Inducirana frakcija jetre štakora S9 sadrži različite enzime koji su uključeni u metabolizam kemikalija faze I i II faze II. To uključuje enzime poput citokroma P450 monooksigenaze, koji olakšavaju oksidativnu biotransformaciju supstrata, oponašajući tako metabolizam ljudske jetre.

CYP450 aktivnost i metabolička aktivacija

Obitelj enzima citokroma P450 (CYP450) igra glavnu ulogu u metabolizmu širokog spektra tvari, uključujući mnoge lijekove, kemikalije za okoliš i karcinogene. Inducirana frakcija jetre štakora S9 sadrži ove enzime i ključna je za procjenu kemikalija koje mogu postati genotoksične tek nakon metaboličke aktivacije.

Mnogi spojevi su u početku ne (toksični, ali mogu postati toksični nakon metabolizma u jetri. Ovi pro - mutageni (koji zahtijevaju metaboličku aktivaciju da postanu mutageni) i pro - karcinogeni (koji zahtijevaju aktivaciju da uzrokuje rak) mogu se otkriti samo ispitivanjima koja uključuju S9 metabolički sustav aktivacije. Bez indukcije metaboličkih enzima poput CYP450, ove tvari mogu biti bezopasne u standardnim testovima genotoksičnosti.

Dodavanjem inducirane jetre štakora S9 in vitro ispitivanjima, istraživači mogu procijeniti kako tvar djeluje s enzimima CYP450. To je posebno važno za lijekove, jer je metabolizam enzima CYP450 presudan korak u farmakokinetici mnogih lijekova.

Primjene inducirane jetre štakora S9

1. 1. Ames test (OECD 471)

Test amesa, navedena u smjerniciOECD 471, jedna je od najpoznatijih i široko korištenih metoda za procjenu mutagenosti. To uključuje izlaganje sojeva bakterija salmonele testnoj kemikaliji kako bi se vidjelo da li inducira mutacije zbog kojih se bakterije vraćaju u histidin - neovisno stanje.

Za simulaciju ljudskog metaboličkog procesa, inducirana jetra štakora S9 često se dodaje u testni sustav. Frakcija S9 osigurava potrebne enzime, uključujući CYP450, za koje se može metabolizirati spoj u reaktivniji oblik koji bi mogao uzrokovati mutacije u bakterijskoj DNK. Ova kombinacija S9 s AMES testom omogućava sveobuhvatniju procjenu mutagenog potencijala oponašajući i izravne i metabolički aktivirane mutagene mehanizme.

2. 2.Mutacijski testovi (test kromosomske aberacije, test mikronukleusa i ostala in vitro ispitivanja)

Uz AMES test, testovi mutacije obično se koriste za procjenu genotoksičnog potencijala kemikalija. Ovi su testovi sveobuhvatniji u procjeni niza genetskih oštećenja, uključujući kromosomske mutacije, mutacije gena i stvaranje mikronukleja. Inducirana jetra štakora S9 koristi se u mutacijskim testovima iz sljedećih razloga:

Mikronukleus test (OECD 487)

Ovaj test otkriva stvaranje mikronukleja u stanicama, a to su mala, ekstranuklearna tijela koja sadrže fragmente kromosoma ili cijele kromosome koji nisu ugrađeni u jezgru tijekom stanične podjele. A test mikronukleusamogu otkriti klastogene (kromosom - razbijanje) i aneugeničke (koji utječu na broj kromosoma). Inducirana jetra štakora S9 koristi se ovdje za aktiviranje metaboličkog ispitivanja, jer neke kemikalije uzrokuju oštećenja kromosomskog samo nakon što se metaboliziraju jetrenim enzimima. Frakcija S9 pojačava osjetljivost testa simulacijom metaboličke aktivacije koja se može pojaviti in vivo.

Test kromosomske aberacije (OECD 473)

Ovaj test procjenjuje može li tvar uzrokovati strukturno oštećenje kromosoma inducirajući prekide, delecije, translokacije ili druge vrste aberacija. Poput testa mikronukleusa,test kromosomske aberacijemože se primijeniti sa ili bez metaboličke aktivacije. Inducirana jetra štakora S9 dodaje se testnom sustavu kako bi oponašala metaboličke procese u jetri, omogućujući procjenu tvari koje možda ne uzrokuju oštećenje kromosomskog u njihovom izvornom obliku, ali to bi moglo učiniti nakon metabolizma jetre.

Tablica 1. Usporedna razmatranja ispitivanja mutacije

HPRT/HGPRT test (OECD 476)

UHPRT/HGPRT test, kulture kineskog hrčka (CHO ili V79) ili stanice humanog limfoblastoida (TK6) izložene su testnoj kemikaliji u prisutnosti inducirane metaboličke mješavine jetre štakora S9, koja opskrbljuje CYP450 enzime potrebne za pretvaranje pro -mutagena u DNA -reaktivne vrste. Nakon kratkog tretmana i sedmodnevnog razdoblja ekspresije, stanice se izazivaju sa 6 -tioguanin; Preživljavaju samo klonovi koji nose mutacije gubitaka u funkciji hipoksantin -guanin fosforiboziltransferaze. Usporedbom broja mutantnih kolonija s ukupnom održivošću, istraživači određuju frekvenciju mutacije koja, ako je reproduktivno povišena i u istodobnoj i povijesnoj kontroli, ukazuje na genotoksični potencijal.

TK ispitivanja (OECD 490 & OECD 476)

ATK test Koristi ili L5178Y stanice limfoma miša (OECD 490) ili Cho stanice (OECD 476) konstruiran heterozigot na lokusu timidin kinaze. Nakon kemijske izloženosti ± S9 mješavina, stanice se oporavljaju i postavljaju se u mediju koji sadrži trifluorotimidin, koji ubija TK -ove stanice. Preživjeli TK⁻ mutanti tvore kolonije tijekom 10–14 dana, s malim kolonijskim mutantima koji često odražavaju kromosomske događaje i mutante velikog koluta koji odražavaju točke mutacije. Kao i u ispitivanju HPRT/HGPRT, stroge kontrole citotoksičnosti i pozitivne mjerila mutagena osiguravaju da promatrano povećanje frekvencije mutacije pouzdano odražava genotoksični rizik spoja.

4. 4. Procjena rizika od raka

Inducirana jetra štakora S9 koristi se i u studijama usmjerenim na procjenu raka - uzrokujući potencijal tvari. Simuliranjem metaboličkih procesa koji se javljaju u ljudskoj jetri, frakcija S9 može pomoći u identificiranju spojeva koji bi mogli dovesti do stvaranja reaktivnih metabolita koji se mogu vezati na DNK i izazivanje mutacija koje bi mogle dovesti do raka.

Poboljšani ames test s induciranom jetrom hrčka S9

Prema najnovijim smjernicama koje je izdala Europska agencija za lijekove (EMA), tradicionalni test AMES -a možda nije dovoljno osjetljiv da otkrije mutageni potencijal određenih nečistoća N - nitrozamina, posebno N - nitrosodimetilamin (NDMA), između ostalih. Stoga je poboljšani AMES test, koji je razvio Nacionalni centar za toksikološka istraživanja (NCTR), podjela američke Uprave za hranu i lijekove (FDA), preporučuje se kao pouzdanija alternativa. Poboljšani AMES test uveo je dodavanje induciranog jetrenog hrčka S9, koji je bio u sadrženi 30% jetre štakora S9 i 30% jetre hrčka S9. Desmosomalni supernatanti štakora i hrčka (S9S) trebaju se pripremiti od jetre glodavaca liječenih enzimom citokroma P450. Korištenjem inducirane jetre hrčka S9, ovaj poboljšani test bolje simulira ljudski metabolizam i povećava pouzdanost rezultata.

Zaključak

Inducirana jetra štakora S9 služi kao kritični alat u testiranju genotoksičnosti, pomažući istraživačima i regulatornim agencijama da procijene mutageni i karcinogeni potencijal kemikalija. Davanjem metaboličkog sustava aktivacije, on poboljšava sposobnost ispitivanja poput AMES testa, ispitivanja mutacije i studija aktivnosti CYP450 za otkrivanje tvari koje zahtijevaju metaboličku aktivaciju da postanu genotoksična. Njegove su primjene ključne za osiguranje sigurnosti novih lijekova, kemikalija i proizvoda široke potrošnje. Svojom ulogom u simulaciji metabolizma ljudske jetre, inducirana frakcija jetre štakora S9 i dalje je neophodan dio moderne procjene toksikologije i regulatorne sigurnosti.