Primarni hepatociti: ključni alat za napredovanje ne - kliničkog istraživanja in vitro lijekova

Primarni hepatociti: ključni alat za napredovanje ne - kliničkog istraživanja in vitro lijekova

Jetra, kao primarni organ za izloženost lijekovima, igra ključnu ulogu u procesima metabolizma lijekova i toksičnosti. Primarni hepatociti posjeduju puni spektar staničnih karakteristika i fiziološke razine enzima i kofaktora, uključujući membrane - vezane enzime poput citokroma P450 (mješovita - funkcionira oksidaza u glatkom endoplazmatskom retikulumu) i citosolskim esterazama, koji se nalaze u jetri. Iz tog razloga, primarni hepatociti široko se smatraju zlatnim standardom za izgradnju in vitro modela jetre, a favoriziraju ih istraživači u interakciji lijekova, metabolizmu lijekova i studija toksičnosti. Ovaj članak daje pregled modela 2D i 3D kulture temeljenih na primarnim hepatocitima i njihovim primjenama u razvoju lijekova.

Ključne riječi: primarni hepatociti, 2D uzgoj, 3D uzgoj, organoidi, co - kultura.

1. 1. Izolacija primarnih hepatocita

Izolacija primarnih hepatocita kritični je korak u uspostavljanju in vitro modela jetre, pri čemu se najčešće koristi dva - koraka kolagenaza perfuzija. Kod manjih životinja perfuzija jetre može se izvesti preko portalne vene ili inferiorne vene kave, dok veće životinje obično zahtijevaju perfuziju kroz režnjeve ili segmente jetre. Nekoliko ključnih čimbenika utječe na uspješnu izolaciju hepatocita: Prvo, kolagenaza bi trebala biti ne - citotoksična. Drugo, vrijeme probave je presudno -I pod - probavom i preko - probava mogu ugroziti prinos i održivost hepatocita. Treće, stanje jetre mora biti optimalno, jer su hepatociti vrlo osjetljivi na ishemijsko oštećenje. Jetra koja se koristi za pripremu hepatocita treba brzo ohladiti kako bi se smanjila stopa metabolizma i spriječila metaboličku hipoksiju i naknadnu ishemiju.

Standardi za primarne hepatocite koji se koriste u istraživanju lijekova su sljedeći:

1. 2. Primarna kultura hepatocita 2d

Model hepatocita suspenzije

Sadrži kompletan lijek - Metaboliziranje enzima i kofaktora, što ga čini prikladnim za proučavanje različitih putova metaboličkog klirensa. Međutim, održivost hepatocita suspenzije i aktivnost lijekova - metabolizirajućih enzima postupno se smanjuju kako se vrijeme in vitro inkubacije povećava, ograničavajući vrijeme inkubacije na najviše 4 sata. Ovaj se model obično koristi za procjenu uklanjanja lijekova s ​​umjerenim do visokim stopama klirensa. Kad je stopa klirensa manja od 20%, ne mogu se utvrditi točne vrijednosti klirensa. Tradicionalni suspenzija hepatocita - temeljeni na vitro modelima metabolizma nisu dovoljni za generiranje metaboličkih reakcija koje se mogu detektirati za sporo - metaboliziranje spojeva, što ograničava njihovu sposobnost predviđanja stope klirensa i metaboličkih proizvoda ovih spojeva. Metoda releja hepatocita od suspenzije (slika 1) može se koristiti za produljenje vremena inkubacije na 20 sati ili čak duže.

Prijava:Enzimska aktivnost i studije metaboličke stabilnosti za lijekove male molekule.

Slika 1. postupak prijenosa releja hepatocita od suspenzije

Izvor: Dissus Metab, 2012.40 (9): 1860–1865

Model hepatocita koji se može plasirati

Primarni hepatociti uzgajaju se u 2D sustavu na pločama o kulturi s kolagenom. Hepatociti pokazuju epitelnu morfologiju, s izbočenim jezgrama, koje se često predstavljaju u binukliranom obliku. Nedostaci jednoslojne kulture jednoslojne jednoslojne hepatocita uključuju: 1. Promjena stanične polarnosti i funkcije.2. Nedostatak drugih relevantnih tipova stanica (tj. Ne -- parenhimske stanice) koje su potrebne za normalnu funkciju.3. Nemogućnost pružanja dovoljnih hranjivih sastojaka i parakrinskih čimbenika za podršku hepatocitima u obavljanju svojih funkcija (poput biosinteze žučnih kiselina i seruma).

Prijave:

1). Procjena lijeka - Interakcije lijekova:To uključuje indukciju enzima, inhibiciju enzima i studije transportera. Prvo, kada lijek djeluje kao induktor, može dovesti do pojačane ekspresije lijeka - metabolizirajućih enzima i transportera. Snažni induktori mogu istovremeno regulirati više gena, poput fenobarbitalne indukcije CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT i nekoliko transportnih proteina poput MRP2. Drugo, postoje vrste - specifične razlike u načinu na koji hepatociti reagiraju na induktore. Na primjer, rifampicin je učinkovit induktor za ljudske i zečje hepatocite, ali nema indukcijskog učinka na hepatocite štakora. Konačno, suboptimalna gustoća oplatavanja hepatocita može dovesti do smanjene bazalne ekspresije P450 i umjetno povećanih indukcijskih odgovora. Kao što je prikazano na slici 3, hepatociti pri nižim gustoćama oplata pokazuju nižu bazalnu aktivnost CYP1A2, CYP2B6 i CYP3A4, ali jače indukcijske odgovore. Stoga su potrebni zdravi hepatociti pri odgovarajućoj gustoći za oplatu za dobivanje fiziološki relevantnih podataka.

Slika 2. Odnos između gustoće oplata kriokonzerviranih ljudskih hepatocita i indukcije enzima

Izvor: Trenutna tehnologija otkrivanja lijekova, 2010, 7: 188 - 198 -

2). Procjena hepatotoksičnosti: Promatranje morfoloških promjena pod laganim mikroskopom, poput stanične morfologije, vakuole i agregacije kapljica lipida i vezanja/odvajanja stanica. Otkrivanje nekroze hepatocita (kako je naznačeno aspartatom aminotransferazom, laktat dehidrogenazom i alaninom aminotransferazom) i apoptozom (fragmentacija DNA). Za citokin - posredovanu citotoksičnost, jednoslojne kulture hepatocita ne mogu predvidjeti toksične reakcije zbog regulacije tvari koje se oslobađaju iz susjednih ne - parenhimskih stanica, poput Kupfferovih stanica, zvjezdanih stanica i sinusoidnih endotelnih stanica.

3). "Metoda releja" za proučavanje sporog metabolizacijskog klirensa i njegovih metabolita: Aktivnost lijekova - metabolizirajući enzime u hepatocitima koji se mogu plasirati počinje se smanjivati ​​nakon 24 sata od oplata. Nakon inkubiranja hepatocita koji se mogu plasirati sa serumom - slobodnim medijem koji sadrži spoj interesa 24 sata, medij se prikuplja i miješa, a zatim prenosi u nove hepatocite za daljnje proučavanje (Slika 3).

Slika 3. Postupak prijenosa releja hepatocita koji se može plasirati

Izvor: Pisma metabolizma lijekova, 2016, 10: 3 - 15

3). Procijenite stanični unos, endocitozu, endosomski bijeg i efekte prigušivanja na ciljni gen hepatocita - ciljanih lijekova malih nukleinskih kiselina.

Model uzgoja sendviča

In vitro, hepatociti se mogu uzgajati između dva sloja kolagena ili matrigela kako bi se rekonstruirali in vivo struktura, poznate kao uzgoj sendviča. Hepatociti uzgajani između dva sloja gela - kolagena (struktura sendviča) mogu poboljšati morfologiju i održivost stanica i održavati njihovu funkcionalnost dužeg razdoblja. Nadalje, hepatociti u kulturi sendviča mogu obnoviti polaritet, omogućujući pravilnu lokalizaciju bazolateralnih i kanalilarnih transportera, kao i stvaranje funkcionalnih mreža žučnih kanala (Slika 4).

Slika 4. Polarizirana ekspresija transportera u modelu sendviča ljudskog hepatocita

Izvor: Trenutna tehnologija otkrivanja lijekova, 2010, 7, 188 - 198. 1988 -

Prijave:

1. 1). Procjena bilijarnog izlučivanja spojeva.
2. 2). Procjena jetrene i bilijarne raspodjele endogenih i egzogenih spojeva i metabolita.
3. 3). Procjena klirensa posredovana metabolizmom i transporterima i konstruiranje fiziologije - farmakokinetičkih modela temeljenih na fiziologiji.
4. 4). Proučavanje hepatotoksičnosti i pružanje mehanizama za klinički lijek - izazvao ozljede jetre. Podaci su integrirani u sustave farmakoloških modela za predviđanje potencijalnih ozljeda jetre kod ljudi.
5.  
   1. 3. Primarna hepatocita 3D kultura

6. U 3D sustavima kulture hepatociti se uzgajaju u tri dimenzionalne matrice, što bolje oponaša in vivo arhitekturu jetre u usporedbi s 2D mono -slojevim kulturama. Ovi sustavi promiču interakcije stanica i stanice i stanice -, koje mogu vratiti više fizioloških funkcija jetre, uključujući metabolizam lijekova, izlučivanje proteina i stvaranje žuči. Primarne 3D kulture hepatocita mogu se upotrijebiti za proučavanje specifičnih funkcija jetre - u in vivo - poput okoliša, nudeći prednosti za testiranje lijekova, procjenu toksičnosti i modeliranje bolesti.

   Sferoidni model

Kroz tehnike kao što su ultra - kultura niske pričvršćivanja, kultura vješanja i magnetska stanična kultura (slika 5), ​​primarni hepatociti mogu se objediniti u sferoidne agregate promjera do 150 - 175 µm bez oslanjanja na vanjske matrice. Jedna prednost sferoidne kulture je ta što svaki sferoid zahtijeva samo 1.330 - 2.000 stanica, što značajno smanjuje broj stanica u usporedbi s drugim tehnikama 3D kulture. Nedavna istraživanja pokazala su da primarne sferoidne kulture hepatocita mogu održati do 5 tjedana, a aktivnost enzima CYP -a ostala je gotovo nepromijenjena između 8. i 35. dana. Proteomička analiza otkrila je da, u usporedbi s sendvičom, enzimi odgovornim za apsorpciju lijekova, distribucije, metabolizma i izlučivanja za 14 dana. Međutim, jetra je mnogo složenija od staničnog agregata. Bazolateralna strana hepatocita djeluje s krvlju, dok žuč izlazi s apikalne strane, što je ključno obilježje složene strukture lobula jetre, a to se još ne može ponoviti u sferoidnom modelu.

Prijave:

1. 1). Proučavanje sporog metabolizirajućeg klirensa spoja i njegovih metabolita.
2. 2). Istraživanje hepatotoksičnosti.
3. 3). Procjena staničnog unosa, endocitoze, endosomalnog bijega i efekata prigušivanja na ciljne gene hepatocita - ciljanih lijekova malih nukleinskih kiselina.

Slika 5. metoda sferoidne kulture

Model jetrenih organoida

Konsenzusna definicija organoida je: 3D strukture izvedene iz matičnih stanica, progenitornih stanica ili diferenciranih stanica, sposobnih za reprodukciju određenih funkcija i struktura nativnog tkiva in vitro, učinkovito oponašajući in vivo mikrookoliš i interakcije stanice - Organoidi jetre identificirani su kao najnapredniji model za istraživanje biologije ljudske jetre.

Stanični izvori za organoidnu konstrukciju jetre:

① Pluripotentne matične stanice (PSCS):

Embrionalne matične stanice (ESC) i inducirane pluripotentne matične stanice (IPSC) posjeduju visoku pluripotenciju, plastičnost i neograničenu proliferativnu sposobnost. Pod utjecajem specifičnih signalnih čimbenika, oni se razlikuju u hepatocite - poput stanica s aktivnošću i funkcijom. Međutim, jetreni organoidi dobiveni iz PSC -a mogu proći epigenetske i genetske promjene, pokazujući kromosomske promjene aneuploidije tijekom pojačanja.

Prijave:

1. 1). Genetski modeli bolesti jetre
2. 2). Zarazne modele bolesti jetre
3. 3). Ispitivanje citotoksičnosti lijekova

② jetreno tkivo - izvedene stanice: uključuju kolangiocite i hepatocite. Zreli hepatociti zadržavaju potencijal matičnih stanica i proliferativnu sposobnost u specifičnim okruženjima. U usporedbi s organoidima izvedenim PSC -, organoidi dobiveni iz primarnog tkiva su zreliji, s stabilnijim genomima i održavaju fenotipsku i genetsku stabilnost tijekom dugog - termina in vitro kulture. Međutim, dugački - proliferativni kapacitet zrelih organoida ljudskog hepatocita ograničen je u usporedbi s fetalnim ljudskim hepatocitima ili primarnim hepatocitima odraslih miša. Kultiranje organoida hepatocita odraslih ostaje izazovno.

Metoda kulture (Slika 6): Tkivo jetre se probavlja u pojedinačne stanice, a mješavina matrigela i stanica se zasijava u ploči od 24 - bušotine kako bi se stvorila struktura u obliku kupole - Inkubirajte u inkubatoru stanične kulture (37 ° C) 15 minuta. Nakon učvršćivanja dodajte specifičan medij za kulturu. Prolaz nakon otprilike 14 dana. Zamijenite originalni medij medijem za diferencijaciju nakon 7 - 10 dana.

Prijave:

1. 1). Modeli hepatotoksičnosti
2. 2). Studije poremećaja metabolizma in vitro
3. 3). Ne - alkoholna masna bolest jetre
4. 4). Razvoj lijekova za benigne i zloćudne bolesti jetre

Slika 6. Proces kulture i prolaza tkiva - izvedeni organoidi jetre

Izvor: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

Usporedba sferoidne kulture i organoidne kulture

4. Primarni model hepatocita Co -

1. 1. 2d primarni hepatocit co - model kulture
      

      U 2D primarnom modelu hepatocita CO - kulture, dva ili više različitih vrsta stanica se miješaju i uzgajaju u dvoje - dimenzionalnom okruženju. Ključna značajka ovog modela je izravna interakcija između različitih tipova stanica, interakcije između stanica i izvanstanične matrice ili prijenosa neizravnog signala putem citokina i kemijske komunikacije. Primarne funkcije hepatocita, poput proizvodnje albumina i sposobnosti metabolizma lijekova, mogu se održavati do tri tjedna.

      Prijave:

      1. 1). Primarni hepatociti Co - kultivirani s fibroblastima: Ovaj se model koristi za proučavanje brzine klirensa sporih - metaboliziranih spojeva i njihovih metabolita.
      2. 2). Primarni hepatociti koji se uzgajaju s ne - parenhimskim stanicama jetre (npr., Stilate, sinusoidne endotelne stanice): Ovaj je model koristan za istraživanje lijekova - izazvanih ozljeda jetre (DILI), jer pomaže u istraživanju uloga citokina nakon modulacije adaptacije jetre.
      3. 3). Primarni hepatociti Co - kultivirani s T stanicama: Ovaj se model koristi za otkrivanje metabolizma lijeka jetre - Specifični T stanica.
      4. 4). IPhase's Hepatomax ™Sustav kulture: ifaza je razvila sustav kulture s primarnim hepatocitima različitih vrsta, poznatih kao Hepatomax™. Kotiziranjem ljudskih primarnih hepatocita sa stromalnim stanicama moguće je održavati dobrog lijeka - metabolizirajući aktivnost enzima u ljudskim hepatocitima do 3 tjedna. Ovaj je sustav prikladan za proučavanje sporog - metaboliziranja stope klirensa spoja i njihovih metabolita.

      Ovaj model kulture pruža fiziološki relevantniju platformu za procjenu metabolizma lijekova, toksičnosti i procesa povezanih s jetrom - srodnim bolestima, nudeći uvid u to kako različiti tipovi stanica doprinose funkciji jetre i bolesti.
      
      

      3D primarni hepatocit co - model kulture

      Izravna 3d co - kultura: Ovaj model uključuje miješanje dvije ili više različitih vrsta jetrenih stanica (npr. Primarni hepatociti, sinusoidne endotelne stanice, jetrene zvjezdane stanice, Kupfferove stanice) kako bi se stvorile samo - sastavljale sferoide ili ih kultivirali u 3D okruženju izgrađenim s materijalima poput materijala, fibrin, ili higrogelsa, ili higrogela. Izravna 3D CO - kultura omogućava blisku interakciju između različitih stanica jetre kroz mehanizme poput stanice - do - adhezije stanice, parakrinske signalizacije putem topljivih citokina i adhezije izvanstanične matrice, što omogućava komunikaciju između hepatocita.

      Prijave:

      1. 1). Model fibroze jetre: Koristi se za proučavanje mehanizama i napredovanja fibroze jetre.
      2. 2). Model ozljede jetre (DILI) induciran lijekom: pomaže simulirati i procijeniti oštećenja jetre uzrokovane lijekovima.
      3. 3). Interakcije lijekova, metabolizam lijekova i indukcija enzima: procjenjuje kako različiti lijekovi djeluju, kako se metaboliziraju i kako induciraju jetreni enzimi.

      Neizravna 3d co - kultura: Ova metoda koristi sustav fizičkog razdvajanja (npr. Transwell ili drugi materijal) u kulturu dvije ili više vrsta stanica (poput primarnih hepatocita s NIH/3T3 stanicama ili sinusoidnim endotelnim stanicama) u 3D okruženju, gdje se sprečava izravna stanica - do - staničnog kontakta. Komunikacija između stanica događa se topljivim citokinima.

      Prijave:
      Koristi se za proučavanje ne -- kontaktne komunikacije između stanica jetre u tijelu.

      
      Ukratko, iPhase, kao lider u in vitro biološkim istraživanjima, pruža sveobuhvatna rješenja za ne -- klinička ispitivanja lijekova. Od izolacije i kulture primarnih hepatocita od različitih vrsta do razvoja potpornih proizvoda kao što su mediji za kulturu za specifične primjene ili više - specifikacijske kolagene - obložene ploče, iPhaza je posvećena nudeći najbolje in vitro istraživačke alate za otkrivanje i razvoj lijekova. Mi smo pouzdan partner za klijente u farmaceutskoj industriji, posvećeni pružanju rezanja - rubnih rješenja za ne -- klinička istraživanja.