Fraksyon Rat Rat S9: Yon sistèm aktivasyon metabolik pou jenotoksisite vitro ak tès mitasyon

Mo kle: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, tès mitasyon, jenotoksisite, toksisite jenetik, rat rat fwa S9, tès Ames, tès mini ames, aberasyon kwomozomik, micronucleus, HPRT/HGPRT assay, assay TK

Pwodwi iPhase

Prezantasyon

Induit rat fwa S9se yon eleman kle nan evalye atoksisite jenetikPotansyèl nan pwodwi chimik yo, espesyalman nan toksikoloji regilasyon. Li se souvan itilize nan konbinezon ak nan vitro assay, tankou laTès ames akTès mitasyon, pou evalye pwopriyete mutagèn nan konpoze. Pa bay sistèm anzimatik ki rich nan sitokrom P450 (CYP450), fraksyon nan fwa rat S9 pwovoke jwe yon wòl enpòtan anpil nan similye pwosesis yo metabolik ki rive nan fwa a, ede detèmine si pwodwi chimik ka potansyèlman lakòz mitasyon jenetik oswa kansè.

Induit rat fwa S9

Fraksyon nan fwa S9 refere a yon post - supèrnatan mitokondriyo jwenn nan homogenates fwa rat apre yon seri de etap santrifigasyon. Tèm nan "pwovoke" refere a tretman an nan rat ak konpoze espesifik ki amelyore aktivite a nan anzim fwa, patikilyèman sitokrom P450 anzim yo (CYP450), ki responsab pou metabolis la nan yon pakèt domèn xenobiotic.

Fraksyon nan fwa rat S9 pwovoke gen yon varyete de anzim ki enplike nan faz I ak faz II metabolis nan pwodwi chimik yo. Sa gen ladan anzim tankou monooxygenases sitokrom P450, ki fasilite biotransformation oksidatif nan substrats, kidonk miman metabolis fwa moun.

Aktivite CYP450 ak aktivasyon metabolik

Fanmi anzim sitokrom P450 (CYP450) jwe yon wòl esansyèl nan metabolis yon gran varyete sibstans, ki gen ladan anpil edikaman, pwodwi chimik anviwònman, ak karsinojèn. Fraksyon nan fwa rat S9 pwovoke gen anzim sa yo epi li se esansyèl pou evalye pwodwi chimik ki ka sèlman vin jenotoksik apre aktivasyon metabolik.

Anpil konpoze yo okòmansman ki pa - toksik men yo ka vin toksik apre metabolis nan fwa a. Sa yo Mutagens Pro - San endiksyon an nan anzim metabolik tankou CYP450, sibstans sa yo ka parèt yo dwe inofansif nan tès jenotoksisite estanda.

Pa ajoute pwovoke rat S9 nan assay nan vitro, chèchè ka evalye ki jan yon sibstans ki sou reyaji ak anzim yo CYP450. Sa a se patikilyèman enpòtan pou edikaman, kòm metabolis pa CYP450 anzim se yon etap kritik nan farmakokinetik yo nan anpil dwòg.

Aplikasyon nan Rat S9 pwovoke S9

1. 1. Tès Ames (OECD 471)

Tès la Ames, ki dekri nan gidOECD 471, se youn nan pi byen - li te ye ak lajman itilize metòd pou evalye mutagenicity. Li enplike ekspoze tansyon nan bakteri Salmonèl nan yon pwodui chimik tès yo wè si li antren mitasyon ki lakòz bakteri yo retounen nan yon histidine - eta endepandan.

Simulation pwosesis metabolik imen an, se pwovoke rat S9 fwa souvan ajoute nan sistèm tès la. Fraksyon nan S9 bay anzim ki nesesè yo, ki gen ladan CYP450, ki ka oblije metabolize konpoze an nan yon fòm plis reyaktif ki ta kapab lakòz mitasyon nan ADN bakteri a. Sa a konbinezon de S9 ak tès la Ames pèmèt pou yon evalyasyon pi konplè sou potansyèl mutagèn pa miman tou de dirèk ak metabolisman aktive mekanism mutagèn.

2. 2.Tès mitasyon (tès aberasyon kwomozomik, tès micronucleus, ak lòt analiz in vitro)

Anplis de tès AMES la, tès mitasyon yo souvan itilize pou evalye potansyèl jenotoksik pwodwi chimik yo. Tès sa yo pi konplè nan evalye yon seri de domaj jenetik, ki gen ladan mitasyon kwomozomik, mitasyon jèn, ak fòmasyon nan micronuclei. Se induit rat fwa S9 itilize nan tès mitasyon pou rezon sa yo:

Tès Micronucleus (OECD 487)

Tès sa a detekte fòmasyon micronuclei nan selil yo, ki se ti, kò extranuclear ki gen fragman nan kwomozòm oswa kwomozòm antye ki pa te enkòpore nan nwayo a pandan divizyon selilè. A tès micronucleuska detekte clastogenic (kwomozòm - kraze) ak aneugenik (ki afekte nimewo kwomozòm) efè. Se induit rat S9 fwa yo itilize isit la yo aktive sibstans ki sou tès la metabolikman, tankou kèk pwodwi chimik sèlman lakòz domaj kwomozomal yon fwa yo te metabolize pa anzim fwa. Fraksyon nan S9 amelyore sansiblite a nan tès la pa similye aktivasyon an metabolik ki ka rive nan vivo.

Tès aberasyon kwomozomik (OECD 473)

Tès sa a evalye si yon sibstans ka lakòz domaj estriktirèl nan kwomozòm pa pwovoke repo, sipresyon, translokasyon, oswa lòt kalite aberasyon. Tankou tès la micronucleus, laTès aberasyon kwomozomikka aplike avèk oswa san aktivasyon metabolik. Se pwovoke rat S9 fwa ajoute nan sistèm tès la imite pwosesis yo metabolik nan fwa a, sa ki pèmèt evalyasyon an nan sibstans ki sou ki pa ta ka lakòz domaj kwomozomik nan fòm orijinal yo, men yo ka fè sa apre metabolis fwa.

Tablo 1. Konsiderasyon konparatif nan tès mitasyon

HPRT/HGPRT assay (OECD 476)

Nan laHPRT/HGPRT assay, kilti nan amstè Chinwa (CHO oswa V79) oswa imen lenfoblastoid (TK6) selil yo ekspoze a chimik la tès nan prezans yon rat pwovoke fwa S9 metabolik melanj, ki founi CYP450 anzim ki nesesè yo konvèti pro -Mutagens nan ADN -reyaktif espès. Apre yon tretman kout ak yon peryòd ekspresyon sèt jou, selil yo defye ak 6 -thioguanine; Se sèlman klon ki pote pèt -of -fonksyon mitasyon nan hypoxanthine -guanine fosforibosyltransferase jèn la siviv. Pa konpare konte koloni mutant ak viabilité an jeneral, chèchè detèmine yon frekans mitasyon ki, si repwodikabl ki wo sou tou de konkouran ak kontwòl istorik, endike potansyèl jenotoksik.

TK assay (OECD 490 & OECD 476)

ATK Assay anplwaye swa L5178Y sourit selil lenfom (OECD 490) oswa CHO selil (OECD 476) Enjenieri eterozigòt nan locus nan timidin kinaz. Apre ekspozisyon chimik ± S9 melanj, selil yo refè epi yo plake nan mwayen ki gen trifluorothymidine, ki touye TK -selil ki fè. Siviv mutan Tk⁻ fòme koloni sou 10-14 jou, ak ti -koloni mutan souvan reflete evènman kwomozomik ak gwo -koloni mutan reflete mitasyon pwen. Kòm nan tès la HPRT/HGPRT, kontwòl sitotoksisite sevè ak referans mutagen pozitif asire ke ogmante obsève nan frekans mitasyon fiable reflete risk jenotoksik yon konpoze an.

4. 4. Evalyasyon risk kansè

Se induit rat fwa S9 tou yo itilize nan etid ki vize a evalye kansè nan - sa ki lakòz potansyèl de sibstans ki sou. Pa similye pwosesis yo metabolik ki rive nan fwa imen an, fraksyon nan S9 ka ede idantifye konpoze ki ta ka mennen nan fòmasyon nan metabolites reyaktif ki kapab obligatwa nan ADN ak sa ki lakòz mitasyon ki ta ka mennen nan kansè.

Enhanced Ames tès ak induit amstè fwa S9

Dapre dènye direktiv ki soti nan Ajans Ewopeyen an Medikaman (EMA), tradisyonèl tès la Ames pa pouvwa ap sansib ase yo detekte potansyèl la mutagèn nan sèten N - enpurte nitrosamine, espesyalman N - nitrosodimethylamine (NDMA), nan mitan lòt moun. Se poutèt sa, tès la Ames ranfòse, devlope pa Sant Nasyonal pou Rechèch toksikolojik (NCTR), yon divizyon nan Administrasyon Manje ak Medikaman Etazini (FDA), te rekòmande kòm yon altènatif plis serye. Tès la Ames ranfòse entwodwi ajoute nan pwovoke amstè S9 fwa, ki fèt nan ki gen 30% rat fwa S9 ak 30% amstè fwa S9. Rat ak amstè desmosomal supernatants (S9s) yo ta dwe prepare soti nan fwa rat trete ak sitokrom P450 anzim - sibstans ki sou pwovoke. Lè l sèvi avèk induit amstè S9 fwa, tès sa a ranfòse pi byen simulation metabolis moun ak ogmante fyab la nan rezilta yo.

Konklizyon

Induit Rat Fwa S9 sèvi kòm yon zouti kritik nan tès jenotoksisite, ede chèchè yo ak ajans regilasyon evalye potansyèl la mutagenik ak kanserojèn nan pwodwi chimik yo. Pa bay yon sistèm aktivasyon metabolik, li amelyore kapasite a nan analiz tankou tès la Ames, tès mitasyon, ak CYP450 etid aktivite yo detekte sibstans ki sou ki mande pou metabolik deklanchman yo vin jenotoksik. Aplikasyon li yo esansyèl pou asire sekirite a nan nouvo dwòg, pwodwi chimik yo, ak pwodwi konsomatè yo. Avèk wòl li nan similye metabolis fwa imen, fraksyon nan rat pwovoke fwa S9 kontinye ap yon pati endispansab nan toksikoloji modèn ak evalyasyon sekirite regilasyon.