Elsődleges májsejtek: A nem - klinikai in vitro gyógyszerkutatás előmozdításához szükséges eszköz

Elsődleges májsejtek: A nem - klinikai in vitro gyógyszerkutatás előmozdításához szükséges eszköz

A máj, mint a gyógyszeres expozíció elsődleges szerve, döntő szerepet játszik a gyógyszer -anyagcserében és a toxicitási folyamatokban. Az elsődleges májsejtek az enzimek és kofaktorok sejtjellemzőinek teljes spektrumával és fiziológiai szintjével rendelkeznek, beleértve a membránt - kötött enzimeket, például a citokróm P450 -et (vegyes - funkciós oxidázt a sima endoplazmatikus retikulumban) és a citoszol -torzákkal, amelyek magukban foglalják a májban található összes metabolikus útvonalat. Ezért az elsődleges májsejteket széles körben tekintik az in vitro májmodellek felépítésének aranyszabványának, és a gyógyszerek kölcsönhatásának, a gyógyszer -anyagcserének és a toxicitási vizsgálatoknak a kutatók részesítik előnyben. Ez a cikk áttekintést nyújt a 2D és a 3D tenyésztési modellekről az elsődleges májsejtek és azok gyógyszerfejlesztésben való alkalmazása alapján.

Kulcsszavak: Elsődleges májsejtek, 2D -tenyésztés, 3D -tenyésztés, organoidok, Co - Tenyészet.

1. 1. Elsődleges májsejtek izolálása

Az elsődleges májsejtek izolálása kritikus lépés az in vitro májmodellek létrehozásában, a leggyakrabban a két - Step kollagenáz perfúziós módszer. Kisebb állatokban a máj perfúziója a portális véna vagy az alacsonyabb szintű vena cava segítségével végezhető el, míg a nagyobb állatok általában perfúziót igényelnek a máj lebenyein vagy szegmensein keresztül. Számos kulcsfontosságú tényező befolyásolja a májsejtek sikeres izolálását: Először is, a kollagenáznak nem - citotoxikusnak kell lennie. Másodszor, az emésztés időzítése döntő jelentőségű -Mind az emésztés, mind a felül - az emésztés veszélyeztetheti a hepatocita hozamát és életképességét. Harmadszor, a máj állapotának optimálisnak kell lennie, mivel a májsejtek nagyon érzékenyek az ischaemiás károsodásokra. A májsejtek előkészítéséhez használt májat gyorsan lehűlni kell az anyagcsere -sebesség csökkentése és a metabolikus hipoxia és az azt követő ischaemia megelőzése érdekében.

A gyógyszerkutatásban alkalmazott primer májsejtek szabványai a következők:

1. 2. Elsődleges májsejt 2d tenyészet

A szuszpenziós májsejt modell

Teljes gyógyszer - metabolizáló enzimeket és kofaktorokat tartalmaz, így alkalmas a különféle metabolikus clearance útvonalak tanulmányozására. A szuszpenziós májsejtek életképessége és a gyógyszer - metabolizáló enzimek aktivitása fokozatosan csökken, amikor az in vitro inkubálási idő növekszik, az inkubációs időt legfeljebb 4 órára korlátozva. Ezt a modellt általában arra használják, hogy becsülje meg a mérsékelt vagy magas clearance sebességgel rendelkező gyógyszerek kiürülését. Ha a kiürülési sebesség kevesebb, mint 20%, akkor a pontos tisztítási értékeket nem lehet meghatározni. Hagyományos szuszpenzió A májsejt alapú in vitro metabolizmus -modellek nem elegendőek a lassú - metabolizáló vegyületek detektálható anyagcsere -reakcióinak előállításához, ezáltal korlátozva azok képességét, hogy megjósolják ezen vegyületek clearance sebességét és metabolikus termékeit. A szuszpenziós májsejt -relé módszer (1. ábra) felhasználható az inkubációs idő meghosszabbítására 20 órára vagy még hosszabbra.

Alkalmazás:Enzimaktivitás és metabolikus stabilitási vizsgálatok a kis molekula gyógyszereknél.

1. ábra.

Forrás: Drug Metab Dispos, 2012,40 (9): 1860–1865

A tenyészthető májsejtek modell

Az elsődleges májsejteket egy 2D rendszerben tenyésztik a kollagén - bevont tenyésztési lemezeken. A májsejtek epiteliális morfológiát mutatnak, kiálló magokkal, gyakran binukleáris formában mutatnak be. Az egyetlen májsejt egyrétegű tenyészet hátrányai a következők: 1. A sejt polaritásának és funkciójának megváltoztatása.2. Más releváns sejttípusok (azaz nem - parenhimális sejtek) hiánya, amelyek szükségesek a normál funkcióhoz.3. Képtelenség elegendő tápanyagot és parakrin tényezőket biztosítani a májsejtek funkcióinak (például az epesav és a szérumfehérje bioszintézis) végrehajtásában.

Alkalmazások:

1). A gyógyszer értékelése - Kábítószer -interakciók:Ez magában foglalja az enzim indukcióját, az enzim gátlását és a transzporter vizsgálatát. Először is, amikor egy gyógyszer indukálóként működik, akkor a gyógyszer - metabolizáló enzimek és transzporterek fokozott expressziójához vezethet. Az erős induktorok egyszerre képesek több gént szabályozni, például a CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT és számos transzportfehérje, például az MRP2 fenobarbitális indukciója. Másodszor, vannak fajok - specifikus különbségek abban, hogy a májsejtek hogyan reagálnak az induktorokra. Például a rifampicin hatékony induktor az emberi és nyúl májsejtek számára, de nincs indukciós hatása a patkány májsejtekre. Végül, a tenyészthető májsejtek szuboptimális bevonási sűrűsége csökkentheti a P450 -ek alapvető expresszióját és a mesterségesen megnövekedett indukciós válaszokat. Amint a 3. ábrán látható, az alacsonyabb bevonási sűrűségű májsejtek alacsonyabb CYP1A2, CYP2B6 és CYP3A4 alapvető aktivitását mutatják, de erősebb indukciós válaszokat mutatnak. Ezért a fiziológiai szempontból releváns adatok megszerzéséhez egészséges májsejtekre van szükség a megfelelő bevonási sűrűség mellett.

2. ábra.

Forrás: Jelenlegi gyógyszer -felfedezési technológiák, 2010, 7: 188 - 198

2). Hepatotoxicitási értékelés: Morfológiai változások megfigyelése fénymikroszkóp alatt, például sejtek morfológiája, vákuum és lipid cseppek aggregációja, valamint a sejtek kötődése/leválasztása. A májsejt -nekrózis kimutatása (az aszpartát -aminotranszferáz, a laktát -dehidrogenáz és az alanin -aminotranszferáz) és az apoptózis (DNS -fragmentáció). A citokin esetében - A citotoxicitás esetében a hepatociták egyetlen egyrétegű tenyészete nem tudja megjósolni a toxikus válaszokat, mivel a szomszédos nem - parenhimális sejtekből felszabadult anyagok, például kupffer sejtek, csillagsejtek és szinuszos endoteliális sejtek felszabadultak.

3). "Relé módszer" a lassú metabolizáló vegyület clearance és metabolitjainak tanulmányozására: A gyógyszer hatása - A metabolizáló enzimek tenyészthető májsejtekben 24 órás bevonás után csökkenni kezd. Miután a tenyészthető májsejteket szérum - szabad tápközeggel inkubáljuk, amely 24 órán át érdekes vegyületet tartalmaz, a tápközeget összegyűjtjük és összekeverik, majd az új tenyészthető májsejtekbe továbbítják további vizsgálat céljából (3. ábra).

3. ábra. Táblázható hepatocita relé módszer átviteli folyamat

Forrás: Kábítószer -metabolizmus levelek, 2016, 10: 3 - 15

3). Értékelje a sejtek felvételét, az endocitózist, az endoszomális menekülést és a hangtompító hatásokat a májsejt célgénjére - célzott kis nukleinsav -gyógyszerek.

Szendvicstermesztési modell

In vitro a májsejteket két kollagén vagy matrigel réteg között lehet tenyészteni, hogy rekonstruálhassák az in vivo struktúrákat, amelyeket szendvicstermesztésnek neveznek. A gél - kollagén (szendvicsszerkezet) közötti két réteg között tenyésztett májsejtek javíthatják a sejtek morfológiáját és életképességét, és hosszabb ideig fenntarthatják funkcionalitásukat. Ezenkívül a szendvics kultúrában a májsejtek helyreállíthatják a polaritást, lehetővé téve a bazolaterális és csatornás transzporterek megfelelő lokalizációját, valamint a funkcionális epevezetékek hálózatainak kialakulását (4. ábra).

4. ábra. A transzporterek polarizált expressziója az emberi májsejt szendvicsmodellben

Forrás: Jelenlegi gyógyszer -felfedezési technológiák, 2010, 7, 188 - 198

Alkalmazások:

1. 1). A vegyületek epe ürülékének becslése.
2. 2). Az endogén és exogén vegyületek és metabolitok máj- és epeeloszlásának értékelése.
3. 3). Az anyagcsere és a transzporterek által közvetített clearance becslése, valamint a fiziológia felépítése -
4. 4). A hepatotoxicitás tanulmányozása és a klinikai gyógyszerek mechanizmusainak biztosítása - indukálta a májkárosodást. Az adatokat a rendszer farmakológiai modellekbe integrálják a potenciális gyógyszerek által kiváltott májkárosodás előrejelzésére az emberekben.
5.  
   1. 3. Elsődleges májsejt 3D tenyészet

6. A 3D -s tenyésztési rendszerekben a májsejteket három - dimenziós mátrixban tenyésztik, amely jobban utánozza az in vivo máj architektúrát a 2D egyrétegű tenyészetekhez képest. Ezek a rendszerek elősegítik a sejtek és a sejtek - mátrix kölcsönhatásait, amelyek helyreállíthatják a máj fiziológiai funkcióit, ideértve a gyógyszer -anyagcserét, a fehérje szekréciót és az epe képződését. Az elsődleges hepatocita 3D tenyészetek felhasználhatók a máj - specifikus funkcióinak tanulmányozására egy in vivo - hasonló környezetben, előnyöket kínálva a gyógyszervizsgálathoz, a toxicitási értékeléshez és a betegség modellezéséhez.

   Gömbmodell

Az olyan technikák révén, mint az ultra - alacsony kötődési tenyészet, a függő csepp tenyésztés és a mágneses sejttenyészet (5. ábra), az elsődleges májsejtek gömbös aggregátumokká tudnak aggregálódni, legfeljebb 150 - 175 µm átmérőjével, anélkül, hogy a külső mátrixokra támaszkodnának. A gömb tenyésztés egyik előnye, hogy minden gömb csak 1330 - 2000 sejtet igényel, ami jelentősen csökkenti a sejtek számát a többi 3D -s tenyésztési technikához képest. A legfrissebb tanulmányok kimutatták, hogy az elsődleges májsejt -gömb tenyészetek akár 5 hétig is fenntarthatják, a CYP enzim aktivitása szinte változatlan marad a 8. és a 35. nap között. A proteomikai elemzés azt mutatta, hogy a szendvicskultúrával összehasonlítva a gyógyszer felszívódásáért, eloszlásáért, metabolizmusáért és az ürülékben 14 napig megőrzött a szűrő kultúrában. A máj azonban sokkal összetettebb, mint a sejtek aggregátuma. A hepatociták bazolaterális oldala kölcsönhatásba lép a vérrel, míg az epikus oldalról kiáramlik, ami a komplex máj lobule szerkezetének kulcsfontosságú jellemzője, és ezt még nem lehet megismételni a szféra modellben.

Alkalmazások:

1. 1). A lassú metabolizáló vegyület clearance és metabolitjainak vizsgálata.
2. 2). Hepatotoxicitási kutatás.
3. 3). A sejtek felvételének, az endocitózisnak, az endoszomális menekülésnek és a hepatocita célgénjeire gyakorolt ​​elnémító hatások értékelése - célzott kis nukleinsav -gyógyszerek.

5. ábra. Gömb tenyésztési módszer

Máj organoidok modellje

Az organoidok konszenzusos meghatározása: az őssejtekből, progenitor sejtekből vagy differenciált sejtekből származó 3D struktúrák, amelyek képesek in vitro, a natív szövet bizonyos funkcióinak és szerkezeteinek reprodukálására, hatékonyan utánozva az in vivo mikrokörnyezetet és a sejteket - a - sejtek kölcsönhatásaihoz. A máj -organoidokat az emberi májbiológiai kutatás legfejlettebb modelljeként azonosították.

Sejtforrások a máj organoid konstrukciójához:

① Pluripotens őssejtek (PSC):

Az embrionális őssejtek (ESC) és az indukált pluripotens őssejtek (IPSC) magas pluripotenciával, plaszticitással és korlátlan proliferációs képességgel rendelkeznek. A specifikus jelátviteli faktorok hatására megkülönböztetik a hepatocytákká, mint az aktivitással és a funkcióval rendelkező sejtek. A PSC -kből származó máj organoidok azonban epigenetikus és genetikai változásokon menhetnek át, és az amplifikáció során kromoszómális aneuploidia változásokat mutatnak.

Alkalmazások:

1. 1). Genetikai májbetegség modellek
2. 2). Fertőző májbetegség modellek
3. 3). Gyógyszer citotoxicitási tesztelés

② Májszövet - származtatott sejtek: Ide tartoznak a kolangiociták és a májsejtek. Az érett májsejtek megőrzik az őssejtek potenciálját és a proliferációs képességet meghatározott környezetben. A PSC - származtatott organoidokkal összehasonlítva az elsődleges szövetekből származó organoidok érettebbek, stabilabb genomokkal, és a fenotípusos és genetikai stabilitást tartják fenn a hosszú - in vitro tenyésztés során. Az érett humán májsejt organoidok hosszú - A felnőtt májsejt organoidok tenyésztése továbbra is kihívást jelent.

Tenyésztési módszer (6. ábra): A májszövetet egysejtekbe emésztik, és a matrigel és a sejtek keverékét egy 24 - kút lemezen oldják, hogy kupola - alakú szerkezeteket képezzenek. Inkubáljon egy sejttenyésztő inkubátorban (37 ° C) 15 percig. A megszilárdulás után adjon hozzá specifikus tápközeget. Áthaladás kb. 14 nap után. Cserélje ki az eredeti közeget differenciálódási tápközegre 7 - 10 nap után.

Alkalmazások:

1. 1). Hepatotoxicitási modellek
2. 2). In vitro metabolizmus rendellenességi vizsgálatok
3. 3). Nem - Alkoholos zsíros májbetegség
4. 4). Kábítószer -fejlődés jóindulatú és rosszindulatú májbetegségek esetén

6. ábra. A szövet tenyészete és áthaladási folyamata - származtatott máj organoidok

Forrás: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

A gömb tenyészet és az organoid tenyészet összehasonlítása

4.

1. 1. 2D primer májsejt Co - Tenyésztési modell
      

      A 2D primer hepatocita Co - tenyésztési modellben két vagy több sejttípust összekeverik és tenyésztenek két - dimenziós környezetben. Ennek a modellnek a legfontosabb jellemzője a különféle sejttípusok közvetlen kölcsönhatása, a sejtek és az extracelluláris mátrix közötti kölcsönhatás, vagy a közvetett jelátvitel citokinek és kémiai kommunikáció révén. Az elsődleges májsejt -funkciók, például az albumin termelése és a gyógyszeres anyagcsere -képesség, legfeljebb három hétig fenntarthatók.

      Alkalmazások:

      1. 1). Elsődleges májsejtek Co - Fibroblastokkal tenyésztve: Ezt a modellt a lassú - metabolizáló vegyületek és metabolitjaik clearance sebességének tanulmányozására használják.
      2. 2). Elsődleges májsejtek Co - nem - parenhimális májsejtekkel (például csillagsejtek, szinuszos endotélsejtek) tenyésztett: Ez a modell hasznos a gyógyszer - indukált májkárosodás (DILI) kutatásában, mivel elősegíti a citokinek, kemokinek és növekedési faktorok szerepének vizsgálatát a máj adaptív reakcióinak modulálásában.
      3. 3). Elsődleges májsejtek CO - T -sejtekkel tenyésztve: Ezt a modellt a máj gyógyszerek metabolizmusának kimutatására használják - specifikus T -sejtválaszok.
      4. 4). Iphase's Hepatomax ™Co - Tenyésztési rendszer: Az iphase kifejlesztett egy Co - kulturális rendszert, amelynek primer májsejtjei különböző fajokból, Hepatomax néven ismertek™ ™- Co - Az emberi primer májsejtek stroma sejtekkel történő tenyésztése során a jó gyógyszer - metabolizáló enzimaktivitást lehet fenntartani az emberi májsejtekben legfeljebb 3 hétig. Ez a rendszer alkalmas a lassú - metabolizáló összetett hézag és metabolitok tanulmányozására.

      Ez a Co - A tenyésztési modell fiziológiailag relevánsabb platformot biztosít a gyógyszer metabolizmusának, toxicitásának és a máj - kapcsolódó betegség -eljárásainak felmérésére, betekintést nyújtva arra, hogy a különböző sejttípusok hogyan járulnak hozzá a májfunkcióhoz és a betegséghez.
      
      

      3D primer májsejt Co - Tenyésztési modell

      Direct 3D Co - Kultúra: Ez a modell magában foglalja két vagy több típusú májsejt (például primer májsejtek, szinuszos endotélsejtek, májsejt -sejtek, Kupffer sejtek) keverését, hogy önmagában - Összeszerelő gömböket vagy Co -t tenyészt, mint például kollagén, fibrin, Alginate vagy hidrogélek. Közvetlen 3D CO - A tenyészet lehetővé teszi a különböző májsejtek közötti szoros kölcsönhatást olyan mechanizmusok révén, mint a sejtek - sejtek adhéziója, paracrin jelátvitel oldható citokinekkel és az extracelluláris mátrix adhézióval, lehetővé téve a hepatociták közötti kommunikációt.

      Alkalmazások:

      1. 1). Májfibrózis modell: A májfibrózis mechanizmusainak és progressziójának tanulmányozására szolgál.
      2. 2). Gyógyszer - indukált májkárosodás (DILI) modell: Segít a gyógyszerek által okozott májkárosodás szimulálásában és felmérésében.
      3. 3). A gyógyszerkölcsönhatások, a gyógyszer -metabolizmus és az enzim indukciója: értékeli, hogy a különböző gyógyszerek hogyan kölcsönhatásba lépnek, hogyan vannak metabolizálva, és hogyan indukálják a máj enzimeket.

      Indirekt 3D CO - Kultúra: Ez a módszer fizikai elválasztási rendszert (például transzwell vagy más anyagokat) használ két vagy több típusú (például primer májsejtek NIH/3T3 sejtekkel vagy szinuszos endotélsejtekkel rendelkező primer májsejtek) tenyésztésére egy 3D környezetben, ahol a közvetlen cella - - sejtek érintkezését megelőzik. A sejtek közötti kommunikáció oldható citokinekkel történik.

      Alkalmazások:
      A testben lévő májsejtek közötti nem érintkezési kommunikáció tanulmányozására használják.

      
      Összefoglalva: az Iphase, mint az in vitro biológiai kutatás vezetője, átfogó megoldásokat kínál a nem - klinikai gyógyszervizsgálathoz. A különböző fajokból származó primer májsejtek izolálásától és kultúrájától kezdve a támogató termékek, például az egyes alkalmazásokhoz vagy a több - specifikációs kollagén - bevont lemezek fejlesztéséig az Iphase a gyógyszerek felfedezéséhez és fejlesztéséhez a legjobb in vitro kutatási eszközök kínálatában. Megbízható partner vagyunk a gyógyszeripar ügyfelei számára, és elkötelezettek a vágási - Edge megoldások biztosításában a nem - klinikai kutatáshoz.