Ներքին առնետի լյարդի S9 կոտորակ. Մետաբոլիկ ակտիվացման համակարգ In vitro Genotoxicity- ի եւ մուտացիայի թեստերի համար

Հիմնաբառեր: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, մուտացիայի թեստ, գենոտոքսիա, գենետիկական թունավորություն, առաջացած առնետի լյարդի S9, AMES թեստ, Mini Ames թեստ, Minronucleus, HPRT / Hgprt Assay, TK Assay

IPhase արտադրանք

Ներածություն

Ներքին առնետի լյարդ S9հիմնական բաղադրիչն է գնահատելու համարԳենետիկ թունավորությունՔիմիական նյութերի ներուժ, հատկապես կարգավորող թունաբանության մեջ: Այն սովորաբար օգտագործվում է Vitro Assays- ի հետ համատեղ, ինչպիսիք ենAmes Test մի քանազորմուտացիայի թեստեր, գնահատել միացությունների մուտագենիկ հատկությունները: Cytochrome P450- ով հարուստ ֆերմենտային համակարգի ապահովմամբ `առաջացած առնետի լյարդի S9 խմբակցությունը վճռական դեր է խաղում լյարդի մեջ տեղի ունեցող նյութափոխանակության գործընթացները մոդելավորելու համար:

Ներքին առնետի լյարդ S9

Լյարդի S9 կոտրումը վերաբերում է գրառմանը - Առնետի լյարդի հոմոգենատներից ստացված mitochondrial գերբնակեցրեք մի շարք կենտրոնական քայլերից հետո: «Առաջացավ» տերմինը վերաբերում է առնետների բուժմանը հատուկ միացություններով, որոնք բարձրացնում են լյարդի ֆերմենտների գործունեությունը, մասնավորապես Cytochrome P450 ֆերմենտները (CYP450), որոնք պատասխանատու են քսենոբիոտիկ լայն տեսականի նյութափոխանակության համար:

Անհայտ առնետի լյարդի S9 խմբակցությունը պարունակում է մի շարք ֆերմենտներ, որոնք ներգրավված են I փուլում եւ II փուլային նյութափոխանակության մեջ: Սա ներառում է ֆերմենտներ, ինչպիսիք են CytoChrome P450 մոնոոքսիզը, որոնք հեշտացնում են ենթաշերտերի օքսիդացնող բիոտրեսանսը, դրանով իսկ ընդօրինակելով մարդու լյարդի նյութափոխանակությունը:

CYP450 գործունեության եւ նյութափոխանակության ակտիվացում

Cytochrome P450 ֆերմենտային ընտանիքը (CYP450) առանցքային դեր է խաղում լայն նյութերի նյութափոխանակության մեջ, ներառյալ բազմաթիվ դեղագործական, բնապահպանական քիմիական նյութեր եւ քաղցկեղներ: Ներքին առնետի լյարդի S9 կոտրումը պարունակում է այդ ֆերմենտները եւ անհրաժեշտ է քիմիական նյութերի գնահատման համար, որոնք կարող են միայն գենոտոքսիկ դառնալ նյութափոխանակության ակտիվացումից հետո:

Շատ միացություններ սկզբում ոչ-ոքի են թունավոր, բայց կարող են լյարդի մեջ նյութափոխանակությունից հետո թունավոր դառնալ: Այս Pro - Mutagens (որոնք պահանջում են մետաբոլիկ ակտիվացում Mentagenic) եւ Pro - Carcinogens (որոնք պահանջում են քաղցկեղի առաջացման ակտիվացում): Առանց CYP450- ի նման նյութափոխանակության ֆերմենտների ինդուկցիայի ինդուկցիայի, այս նյութերը կարող են անվնաս լինել ստանդարտ գենոտոքսիկության թեստերում:

Հետազոտողները կարող են ավելացնելով առնետի լյարդի S9- ին, հետազոտողները կարող են գնահատել, թե ինչպես է նյութը փոխազդում CYP450 ֆերմենտների հետ: Սա հատկապես կարեւոր է դեղագործական միջոցների համար, քանի որ CYP450 ֆերմենտների նյութափոխանակությունը շատ դեղամիջոցների ֆարմակոկինետիկայի մեջ կրիտիկական քայլ է:

Հայտարարված առնետի լյարդի S9- ի ծրագրեր

1. 1. AMES թեստ (OECD 471)

AMES թեստը, ուրվագծված է ուղեցույցումOECD 471, ամենալավը հայտնի է եւ լայնորեն օգտագործված մեթոդներ `մուտագենությունը գնահատելու համար: Այն ներառում է Salmonella բակտերիաների շտկումը թեստային քիմիական նյութի վրա, տեսնելու, թե արդյոք այն դրդում է մուտացիաներ, որոնք բակտերիաները առաջացնում են պատմության մեջ:

Մարդկային նյութափոխանակության գործընթացը մոդելավորելու համար առաջացած առնետի լյարդի S9- ը հաճախ ավելացվում է թեստային համակարգում: S9 Fraction- ը ապահովում է անհրաժեշտ ֆերմենտներ, ներառյալ CYP450- ը, որոնք կարող են պահանջվել նյութափոխանակել ավելի շատ ռեակտիվ ձեւով, որը կարող է բակտերիալ ԴՆԹ-ի մուտացիաներ առաջացնել: S9- ի այս համադրությունը AMES թեստով թույլ է տալիս ավելի ընդգրկուն գնահատել մուտագենային ներուժը `ընդօրինակելով ինչպես ուղղակի, այնպես էլ նյութափոխանակորեն ակտիվացված մուտագենիկ մեխանիզմները:

2. 2.Մուտացիայի թեստեր (քրոմոսոմային տապալման թեստ, MICRRONUCLEUS թեստ եւ այլ in vitro- ի փորձարկումներ)

Բացի AMES թեստից, մուտացիայի թեստերը սովորաբար օգտագործվում են քիմիական նյութերի գենոտոքսիկ ներուժը գնահատելու համար: Այս թեստերն ավելի ընդգրկուն են գենետիկ վնաս պատճառելու մի շարք, ներառյալ քրոմոսոմային մուտացիաները, գենի մուտացիաները եւ Micronuclei- ի ձեւավորումը: Անհանգստացված առնետի լյարդ S9- ը օգտագործվում է մուտացիայի թեստերում հետեւյալ պատճառներով.

Micronucleus Test (OECD 487)

Այս թեստը հայտնաբերում է բջիջներում գտնվող միկրոնուկի ձեւավորումը, որոնք փոքր են, քրոմոսոմների բեկորներ կամ ամբողջ քրոմոսոմների բեկորներ, որոնք բջիջների բաժնի մեջ ներառված չեն միջուկի մեջ: Է Միկրոնուկի թեստկարող է հայտնաբերել կլաստոգենիկ (քրոմոսոմային - կոտրելը) եւ անեուգենիկ (ազդելով քրոմոսոմի համարի) էֆեկտների վրա: Անհանգստացած առնետի լյարդի S9- ն օգտագործվում է այստեղ `թեստային նյութը նյութափոխանակության ակտիվացման համար, քանի որ որոշ քիմիական նյութեր միայն քրոմոսոմային վնաս են պատճառում լյարդի ֆերմենտներով: S9 խմբակցությունը ուժեղացնում է թեստի զգայունությունը `մոդելավորելով նյութափոխանակության ակտիվացումը, որը կարող է առաջանալ Vivo- ում:

Քրոմոսոմային տապալման թեստ (OECD 473)

Այս թեստը գնահատում է, թե արդյոք նյութը կարող է առաջացնել քրոմոսոմների կառուցվածքային վնասներ `խախտելով ընդմիջումներ, ջնջումներ, վերաբաշխումներ կամ տատանումների այլ տեսակներ: Մանրրոնուկի թեստի նման,Քրոմոսոմային տապալման թեստկարող է կիրառվել նյութափոխանակության ակտիվացման կամ առանց դրա: Անհանգստացված առնետի լյարդ S9- ը թեստային համակարգում ավելացվում է լյարդի նյութափոխանակության գործընթացները, թույլ տալով գնահատել այն նյութերը, որոնք կարող են քրոմոսոմային վնաս պատճառել իրենց սկզբնական ձեւով:

Աղյուսակ 1. Ատագրական թեստերի համեմատական ​​նկատառումներ

HPRT / Hgprt Assay (OECD 476)

ՄեջHPRT / HGPRT ASSAY, չինական համստերների (ընտրովի կամ V79) կամ մարդկային լիմֆոբլաստոիդային (TK6) բջիջները ենթարկվում են թեստային քիմիական նյութի, առաջացած առնետի լյարդի S9 Metabolic խառնուրդի առկայության դեպքում, որն ապահովում է CYP450 ֆերմենտներ, որոնք անհրաժեշտ են վերափոխել դա-ռեակտիվ տեսակների: Հակիրճ բուժումից եւ յոթօրյա արտահայտության ժամանակահատվածից հետո բջիջները վիճարկվում են 6-thioguanine- ի հետ. Միայն հիպոքսպանթին-Գուենինի ֆոսֆորիբոսիլտրսֆերսֆերայի գեների գեների գեների գենը կրող միայն կլոնները Համեմատելով մուտանտի գաղութի հաշվարկները ընդհանուր կենսունակության համար, հետազոտողները որոշում են մուտացիայի հաճախականությունը, որ եթե վերարտադրվում են վերարտադրվող, այնպես էլ պատմական վերահսկողությամբ վերարտադրվող, նշում է գենոտոքսիկ ներուժը:

TK Assays (OECD 490 & OECD 476)

ԷTK- ի փորձ աշխատում է կամ L5178Y մկնիկի Lymphoma բջիջներ (OECD 490) կամ Cho բջիջներ (OECD 476) ինժեներական Herterozygous- ը Thymidine Kinase Locus- ում: Քիմիական ազդեցության հետեւից ± S9 Mix- ը վերականգնում է, բջիջները վերականգնվում են եւ ծածկված են միջին պարունակող տրիֆլորոտիմիդին, որը սպանում է TK-Proficticent բջիջները: Գոյատեւելով TK⁻ մուտանտի գաղութները ավելի քան 10-14 օրվա ընթացքում, փոքր գաղութի մուտանտներով հաճախ արտացոլում են քրոմոսոմային միջոցառումներ եւ մեծ գաղութի մուտանտներ, որոնք արտացոլում են կետային մուտացիաները: Ինչպես HPRT / HGPRT փորձարկումներում, ցիտոտոքսիկության խիստ հսկիչները եւ դրական մուտացիայի հենանիշները ապահովում են, որ մուտացիայի հաճախության նկատելի աճը հուսալիորեն արտացոլում է մի բարդի գենոտոքսիկ ռիսկը:

4. 4. Քաղցկեղի ռիսկի գնահատում

Ներքին առնետի լյարդի S9- ը օգտագործվում է նաեւ քաղցկեղի գնահատմանն ուղղված ուսումնասիրություններում - նյութերի ներուժի պատճառ դառնալը: Սիմուլյոլիկ գործընթացները, որոնք տեղի են ունենում մարդու լյարդի մեջ, S9 կոտրումը կարող է օգնել նույնականացնել միացությունները, որոնք կարող են հանգեցնել ռեակտիվ նյութափոխանակության ձեւավորմանը, որոնք ունակ են Կապել ԴՆԹ-ին, որը կարող է հանգեցնել, ինչը կարող է հանգեցնել քաղցկեղի:

Ընդլայնված AMES թեստ `առաջացած Hamster Living S9- ի հետ

Եվրոպական դեղամիջոցների գործակալության (EMA) կողմից թողարկված վերջին ուղեցույցի համաձայն, ավանդական AMES թեստը կարող է այնքան զգայուն լինել որոշակի N- ի մուտոտոգենային ներուժը հայտնաբերելու համար: Հատկապես n - Nitrosodimethylamine (NDMA): Հետեւաբար, բարձր հուսալի այլընտրանք է առաջարկվել է «Տոքսիկոլոգիական հետազոտությունների ազգային կենտրոնի» (ՀՌԱՀ) կողմից մշակված ուժեղացված AMES թեստը: Ընդլայնված AMES թեստը ներդրել է առաջացած Hamster Living S9- ի հավելում, որը պարունակում է 30% առնետի լյարդի S9 եւ 30% Hamster Living S9: Rat and Hamster Desmosomal գերբնակունները (S9S) պետք է պատրաստված լինեն Cytochrome P450 ֆերմենտով բուժվող կրծող լյարդից: Օգտագործելով առաջացած Hamster Living S9- ը, այս ուժեղացված թեստը ավելի լավ է նմանեցնում մարդու նյութափոխանակությունը եւ մեծացնում արդյունքների հուսալիությունը:

Եզրափակում

Անհայտ առնետի լյարդի S9- ը ծառայում է որպես գենոտոքսիկության փորձարկման կարեւորագույն գործիք, օգնելով հետազոտողներին եւ կարգավորող գործակալություններին գնահատել քիմիական նյութերի մուտագենային եւ քաղցկեղածին ներուժը: Մետրաբոլիկ ակտիվացման համակարգ տրամադրելով, այն ուժեղացնում է գույքային փորձարկման, մուտացիայի թեստերի եւ CYP450 գործունեության ուսումնասիրությունների հնարավորությունը `նյութերը դառնան նյութափոխանակության ակտիվացում: Դրա դիմումները անհրաժեշտ են նոր դեղերի, քիմիական նյութերի եւ սպառողական ապրանքների անվտանգության ապահովման համար: Մարդկային լյարդի նյութափոխանակությունը սիմուլյացիայի դերով իր դերակատարմամբ, առաջացած առնետի լյարդի S9 խմբակցությունը շարունակում է մնալ ժամանակակից թունաբանության եւ կարգավորող անվտանգության գնահատումների անփոխարինելի մաս: