Aðal lifrarfrumur: Mikilvægt tæki til að efla ekki klínískar rannsóknir á lyfjum í in vitro

Aðal lifrarfrumur: Mikilvægt tæki til að efla ekki klínískar rannsóknir á lyfjum í in vitro

Lifur, sem aðal líffæri fyrir útsetningu fyrir lyfjum, gegnir lykilhlutverki í umbrotum lyfja og eiturhrifaferlum. Aðal lifrarfrumur hafa allt litróf frumueinkenna og lífeðlisfræðilegt magn ensíma og cofactors, þar með talið himna - bundin ensím eins og cýtókróm P450 (blandað - virkni oxíðasa í sléttum endoplasmic reticulum) og cýtósólískum esterasum, sem nær yfir allar efnaskiptaleiðir sem finnast í lifrinni. Af þessum sökum eru aðal lifrarfrumur almennt litið á gullstaðalinn til að smíða in vitro lifrarlíkön og er studdur af vísindamönnum í samspili lyfja, umbrot lyfja og eiturhrifarannsóknir. Þessi grein veitir yfirlit yfir 2D og 3D menningarlíkön byggð á aðal lifrarfrumum og notkun þeirra í lyfjaþróun.

Lykilorð: Aðal lifrarfrumur, 2D ræktun, 3D ræktun, organoids, co - menning.

1. 1. einangrun aðal lifrarfrumna

Einangrun aðal lifrarfrumna er mikilvægt skref til að koma á in vitro lifrarlíkönum, þar sem tvö - Step kollagenase perfusion aðferðin er mest notuð. Hjá smærri dýrum er hægt að framkvæma lifrarferli með gáttinni eða óæðri vena cava, á meðan stærri dýr þurfa venjulega flæði í gegnum lifrar lobes eða hluti. Nokkrir lykilþættir hafa áhrif á árangursríka einangrun lifrarfrumna: Í fyrsta lagi ætti kollagenasi að vera ekki - frumudrepandi. Í öðru lagi, tímasetning meltingarinnar skiptir sköpum -Bæði undir - meltingu og yfir - melting getur haft áhrif á afrakstur lifrarfrumna og hagkvæmni. Í þriðja lagi verður lifrarástand að vera best þar sem lifrarfrumur eru mjög viðkvæmar fyrir blóðþurrðarskemmdum. Lifur sem notuð er við lifrarfrumublöndu ætti að kæla hratt til að draga úr efnaskiptahraða og koma í veg fyrir efnaskipta súrefnisskortur og blóðþurrð í kjölfarið.

Staðlarnir fyrir aðal lifrarfrumur sem notaðir eru við lyfjarannsóknir eru eftirfarandi:

1. 2. aðal lifrarfrumur 2D menning

Fjöðrunar lifrarfrumu líkanið

Það inniheldur fullkomið lyf - Umbrotsensím og samverkandi, sem gerir það hentugt til að rannsaka ýmsar efnaskiptaþjónustuleiðir. Hins vegar minnkar lífvænleiki sviflausnar lifrarfrumur og virkni lyfja - umbrotsensím smám saman eftir því sem in vitro ræktunartíminn eykst og takmarkar ræktunartíma að hámarki 4 klukkustundir. Þetta líkan er venjulega notað til að meta úthreinsun lyfja með í meðallagi til háu úthreinsunarhlutfalli. Þegar úthreinsunarhlutfallið er minna en 20%er ekki hægt að ákvarða nákvæmar úthreinsunargildi. Hefðbundin sviflausn lifrarfrumu - byggð in vitro umbrotslíkön eru ófullnægjandi til að búa til greinanleg efnaskiptaviðbrögð fyrir hægt - umbrotsefnasambönd og takmarka þannig getu þeirra til að spá fyrir um úthreinsunarhraða og efnaskiptaafurðir þessara efnasambanda. Hægt er að nota fjöðrun lifrarfrumuaðferðar (mynd 1) til að lengja ræktunartímann í 20 klukkustundir eða jafnvel lengur.

Umsókn:Enzyme virkni og efnaskipta stöðugleikarannsóknir á litlum sameindalyfjum.

Mynd 1. Sviflausn lifrarfrumu Relay aðferð til flutnings

Heimild: lyfjameðferð, 2012,40 (9): 1860–1865

Platanlegt lifrarfrumu líkanið

Aðal lifrarfrumur eru ræktaðar í 2D kerfi á kollageni - húðuðum ræktunarplötum. Lifrarfrumurnar sýna þekjuform af útstæðum kjarna, sem oft er kynnt í binucleated formi. Gallar við stakar lifrarfrumur einlyfjamenningu eru: 1. Breyting á frumu pólun og virkni.2. Skortur á öðrum viðeigandi frumutegundum (þ.e.a.s. ekki - parenchymal frumur) sem eru nauðsynlegar fyrir venjulega virkni.3. Vanhæfni til að veita nægileg næringarefni og paracrine þætti til að styðja við lifrarfrumur við að framkvæma hlutverk sín (svo sem gallsýru og nýmyndun í próteini í sermi).

Forrit:

1). Mat á lyfjum - Milliverkanir á lyfjum:Þetta felur í sér örvun ensíma, ensímhömlun og flutningsrannsóknir. Í fyrsta lagi, þegar lyf virkar sem hvatning, getur það leitt til aukinnar tjáningar á lyfjum - umbrotsensím og flutningsmenn. Sterkir örvar geta komið upp mörgum genum samtímis, svo sem fenobarbital örvun CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT og nokkur flutningsprótein eins og MRP2. Í öðru lagi eru til tegundir - sérstakur munur á því hvernig lifrarfrumur bregðast við örvum. Til dæmis er rifampicin árangursrík örvandi fyrir lifrarfrumur úr mönnum og kanínum, en hefur engin örvunaráhrif á lifrarfrumur rottna. Að lokum getur þéttleiki platanlegra lifrarfrumna leitt til minni basal tjáningu P450s og tilbúnar aukin örvunarviðbrögð. Eins og sýnt er á mynd 3 sýna lifrarfrumur við lægri þéttleika lægri grunnvirkni CYP1A2, CYP2B6 og CYP3A4, en sterkari örvunarviðbrögð. Þess vegna eru heilbrigðar lifrarfrumur við viðeigandi málhúðþéttleika nauðsynlegar til að fá lífeðlisfræðilega viðeigandi gögn.

Mynd 2. Samband milli þéttleika cryopreserved lifrarfrumna manna og örvunar ensíma

Heimild: Núverandi lyfjagreiningartækni, 2010, 7: 188 - 198

2). Mat á eituráhrifum á lifur: Að fylgjast með formfræðilegum breytingum undir ljós smásjá, svo sem formgerð frumna, lofttegund og fitusöfnun dropar og festingu/aðskilnað frumna. Greining á drep í lifrarfrumum (eins og gefið er til kynna með aspartat amínótransferasa, laktat dehýdrógenasa og alanín amínótransferasa) og apoptosis (DNA sundrungu). Fyrir cýtókín - miðlað frumudrepandi áhrif geta stakar einlagaræktar lifrarfrumna ekki spáð fyrir um eitruð svörun vegna reglugerðar með efnum sem eru losaðar úr nærliggjandi non - parenchymal frumum, svo sem kupffer frumum, stellate frumum og sinusoidal æðaþelsfrumum.

3). „Relay Method“ til að rannsaka hægt umbrotsefnasambandsúthreinsun og umbrotsefni þess: Virkni lyfja - Umbrotsensím í platanlegum lifrarfrumum byrjar að minnka eftir sólarhring af málun. Eftir að hafa ræktað lifrarfrumur með sermi - frjáls miðill sem inniheldur efnasambandið sem hefur áhuga í sólarhring er miðlinum safnað og blandað og síðan flutt í nýjar platanlegar lifrarfrumur til frekari rannsóknar (mynd 3).

Mynd 3.

Heimild: Lækkanir um umbrot lyfja, 2016, 10: 3 - 15

3). Metið upptöku frumna, endocytosis, endosomal flótta og þaggandi áhrif á markgen lifrarfrumna - markviss lítil kjarnsýrulyf.

Samloku ræktunarlíkan

In vitro er hægt að rækta lifrarfrumur milli tveggja laga af kollageni eða Matrigel til að endurgera in vivo mannvirki, þekkt sem samloku ræktun. Lifrarfrumur, sem ræktaðar eru á milli tveggja laga af hlaupi - kollagen (samlokuuppbygging) geta bætt formgerð og lífvænleika frumanna og viðhaldið virkni þeirra í lengri tíma. Ennfremur geta lifrarfrumur í samloku ræktun endurheimt pólun, sem gerir kleift að staðsetning á basolateral og canalicular flutningum, svo og myndun virkra gallleiðslna (mynd 4).

Mynd 4. skautað tjáning flutningafólks í lifrarfrumu samloku manna

Heimild: Núverandi lyfjagreiningartækni, 2010, 7, 188 - 198

Forrit:

1. 1). Mat á útskilnaði í gallum.
2. 2). Mat á dreifingu lifrar og galls á innrænu og utanaðkomandi efnasamböndum og umbrotsefnum.
3. 3). Mat á úthreinsun miðlað af umbrotum og flutningum og smíði lífeðlisfræði - byggð lyfjahvarfalíkön.
4. 4). Að rannsaka eituráhrif á lifur og veita fyrirkomulag fyrir klínískt lyf - framkallað lifrarskaða. Gögn eru samþætt í lyfjafræðilíkön kerfisins til að spá fyrir um mögulega lyf - framkallað lifrarskaða hjá mönnum.
5.  
   1. 3.. Aðal lifrarfrumur 3D menning

6. Í þrívíddarkerfum eru lifrarfrumur ræktaðar í þriggja - víddar fylki, sem líkir betur eftir in vivo lifrar arkitektúr samanborið við 2D einlaga menningu. Þessi kerfi stuðla að frumu - frumu og frumu - fylkis milliverkanir, sem geta endurheimt meira af lífeðlisfræðilegum aðgerðum lifur, þ.mt umbrot lyfja, prótein seytingu og gallmyndun. Hægt er að nota aðal lifrarfrumur 3D ræktun til að rannsaka lifur - Sértækar aðgerðir í meira in vivo - eins og umhverfi, bjóða upp á kosti við lyfjapróf, eituráhrifamat og líkan af sjúkdómum.

   Kúlulaga líkan

Með tækni eins og Ultra - lágum festingarrækt, hangandi droparækt og segulfrumurækt (mynd 5), geta aðal lifrarfrumur safnast saman í kúlulaga samanlagðir með þvermál allt að 150 - 175 µm án þess að treysta á ytri fylki. Einn kostur kúlulaga ræktunar er að hver kúlulaga þarf aðeins 1.330 - 2.000 frumur, sem fækkar marktækt fjölda frumna samanborið við aðrar 3D ræktunartækni. Nýlegar rannsóknir hafa sýnt að aðal lifrarfrumur kúlulaga ræktun getur haldið uppi í allt að 5 vikur, þar sem CYP ensímvirkni var áfram nánast óbreytt á milli dags 8 og dags 35. Proteomics greining leiddi í ljós að samanborið við samloka ræktun, eru ensím sem bera ábyrgð á frásog lyfja, dreifingu, umbrotum og útskilnaði betri í 14 daga í spheroid menningu. Hins vegar er lifur mun flóknari en frumu samanlagður. Basolateral hlið lifrarfrumna hefur samskipti við blóð, meðan gallinn rennur út frá apical hliðinni, sem er lykilatriði í flóknu uppbyggingu lifrar lobule, og það er ekki enn hægt að endurtaka það í kúlulaga líkaninu.

Forrit:

1. 1). Rannsókn á hægum umbrotsefnasamböndum og umbrotsefnum þess.
2. 2). Rannsóknir á eituráhrifum á lifur.
3. 3). Mat á upptöku frumna, endocytosis, endosomal flótta og þaggandi áhrif á markgen lifrarfrumna - markviss lítil kjarnsýrulyf.

Mynd 5. Kúlulaga ræktunaraðferð

Lifar líffæralíkan

Skilgreining samsetningar á líffærum er: 3D mannvirki sem eru fengin úr stofnfrumum, frumum frumum eða aðgreindum frumum, sem geta endurskapað ákveðnar aðgerðir og mannvirki innfæddra vefja in vitro, sem líkir eftir in vivo örumhverfi og frumu - við - frumu milliverkanir. Lifur líffæralyf hafa verið greind sem fullkomnasta líkan fyrir rannsóknir á lifur líffræði manna.

Frumuuppsprettur fyrir smíði líffæra í lifur:

① pluripotent stofnfrumur (PSC):

Stofnfrumur fósturvísis (ESC) og framkölluðu pluripotent stofnfrumur (IPSC) hafa mikla pluripotency, mýkt og ótakmarkaða fjölgunargetu. Undir áhrifum sértækra merkjaþátta aðgreina þeir í lifrarfrumu - eins og frumur með virkni og virkni. Samt sem áður geta lifur líffæraefni, sem fengnar eru úr PSC, gangast undir erfðabreytingar og erfðabreytingar, sem sýnt var litningagreiningarbreytingar við mögnun.

Forrit:

1. 1). Erfðafræðileg lifrarsjúkdómalíkön
2. 2). Smitandi lifrarsjúkdómalíkön
3. 3). Prófun á eituráhrifum á lyfjum

② lifurvef Þroskaðir lifrarfrumur halda stofnfrumum möguleika og fjölgun getu í sérstöku umhverfi. Í samanburði við PSC - afleidd líffæri, eru líffærafræðilegir úr aðalvefjum þroskaðri, með stöðugri genamengjum, og viðhalda svipgerð og erfðafræðilegum stöðugleika á löngum - hugtaki in vitro ræktun. Hins vegar er langan - tímabundin fjölgun þroska þroskaðra lifrarfrumna líffæraefni takmörkuð samanborið við lifrarfrumur manna eða aðal lifrarfrumur úr músum. Með því að rækta líffrumur á lifrarfrumum er enn krefjandi.

Ræktunaraðferð (mynd 6): Lifrarvefur er melt í stakar frumur og blanda af Matrigel og frumum er sáð í 24 - holu plötu til að mynda hvelfingu - laga mannvirki. Ræktaðu í frumuræktarskúffu (37 ° C) í 15 mínútur. Bætið við sérstökum ræktunarmiðli eftir storknun. Yfirferð eftir um það bil 14 daga. Skiptu um upprunalega miðilinn með aðgreiningarmiðli eftir 7 - 10 daga.

Forrit:

1. 1). Líkan af eituráhrifum á lifur
2. 2). Rannsóknir in vitro umbrotsjúkdómar
3. 3). Ekki - áfengi fitusjúkdómur í lifur
4. 4). Lyfjaþróun fyrir góðkynja og illkynja lifrarsjúkdóma

Mynd 6. Ræktun og leiðarferli vefja - afleiddir lifur

Heimild: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

Samanburður á kúlulaga ræktun og líffæramenningu

4. aðal lifrarfrumu CO - Ræktunarlíkan

1. 1. 2d aðal lifrarfrumu CO - Ræktunarlíkan
      

      Í 2D aðal lifrarfrumu CO - ræktunarlíkaninu eru tvær eða fleiri mismunandi frumugerðir blandaðar og ræktaðar í tveggja - víddarumhverfi. Lykilatriðið í þessu líkani er bein samspil mismunandi frumutegunda, samspil frumna og utanfrumu fylkisins, eða óbeina merkjasendinguna með frumum og efnasamskiptum. Hægt er að viðhalda aðal lifrarfrumuaðgerðum, svo sem albúmínframleiðslu og umbrotsgetu lyfja, í allt að þrjár vikur.

      Forrit:

      1. 1). Aðal lifrarfrumur CO - ræktað með fibroblasts: Þetta líkan er notað til að rannsaka úthreinsunarhraða hægs - umbrotsefnasambanda og umbrotsefni þeirra.
      2. 2). Aðal lifrarfrumur CO - ræktaðar með ekki - parenchymal lifrarfrumum (t.d. stjörnufrumur, sinusoidal æðaþelsfrumur): Þetta líkan er gagnlegt til að rannsaka lyf - framkallað lifrarskaða (DILI), þar sem það hjálpar til við að kanna hlutverk cýtókína, kemókína og vaxtarþátta við að breyta lifur aðlögunarviðbrögðum eftir útsetningu fyrir lyfjum.
      3. 3). Aðal lifrarfrumur CO - ræktað með T frumum: Þetta líkan er notað til að greina umbrot lifrarlyfja - Sértæk viðbrögð T frumna.
      4. 4). Hepatomax ™ iPhaseCO - Ræktunarkerfi: Iphase hefur þróað CO - menningarkerfi með aðal lifrarfrumum frá mismunandi tegundum, þekkt sem lifrar™. Með því að rækta aðal lifrarfrumur manna með stromal frumum er mögulegt að viðhalda góðum lyfjum - Umbrotsensímvirkni í lifrarfrumum í mönnum í allt að 3 vikur. Þetta kerfi er hentugur til að rannsaka hægt - umbrotsefnið og umbrotsefni þeirra.

      Þetta CO - ræktunarlíkan veitir lífeðlisfræðilega viðeigandi vettvang til að meta umbrot lyfja, eiturhrif og lifur - tengda sjúkdómsferli og bjóða upp á innsýn í það hvernig mismunandi frumutegundir stuðla að lifrarstarfsemi og sjúkdómum.
      
      

      3D aðal lifrarfrumu CO - Ræktunarlíkan

      Bein 3D CO - menning: Þetta líkan felur í sér að blanda saman tveimur eða fleiri mismunandi tegundum lifrarfrumna (t.d. aðal lifrarfrumur, sinusoidal æðaþelsfrumum, lifrarstjörnufrumum, kupffer frumum) til að mynda sjálf - samsettar kúlulaga eða co - ræktun í 3D umhverfi smíðað með efnum eins og kollagen, fibrin, alginat eða vetrar. Bein 3D CO - Ræktun gerir kleift að ná nánu samspili mismunandi lifrarfrumna með aðferðum eins og frumu - við - frumuviðloðun, paracrine merki með leysanlegum frumum og utanfrumu fylkis viðloðun, sem gerir kleift að hafa samskipti milli lifrarfrumna.

      Forrit:

      1. 1). Lifur á lifrarvef: Notað til að rannsaka fyrirkomulag og framvindu lifrarfíbrosis.
      2. 2). Lyf - framkallað lifrarskaði (Dili) líkan: hjálpar til við að líkja eftir og meta lifrarskemmdir af völdum lyfja.
      3. 3). Milliverkanir á lyfjum, umbrot lyfja og örvun ensíma: Meta hvernig mismunandi lyf hafa samskipti, hvernig þau eru umbrotin og hvernig þau örva lifrarensím.

      Óbein 3d co - menning: Þessi aðferð notar líkamlegt aðskilnaðarkerfi (t.d. transwell eða önnur efni) til að rækta tvær eða fleiri tegundir frumna (svo sem aðal lifrarfrumur með NIH/3T3 frumum eða sinusoidal æðaþelsfrumum) í 3D umhverfi, þar sem komið er í veg fyrir bein frumu - til - snertingu frumna. Samskipti milli frumanna eiga sér stað með leysanlegum frumum.

      Forrit:
      Notað til að rannsaka samskipti án - snertingu milli lifrarfrumna í líkamanum.

      
      Í stuttu máli, Iphase, sem leiðandi í líffræðilegum rannsóknum í in vitro, veitir alhliða lausnir fyrir klínískar lyfjaprófanir. Frá einangrun og menningu aðal lifrarfrumna frá ýmsum tegundum til þróunar á stuðningsafurðum eins og ræktunarmiðlum fyrir sérstök forrit eða fjölvídd kollagen - Húðaðar plötur, er iPhase tileinkaður því að bjóða upp á bestu in vitro rannsóknartæki fyrir uppgötvun og þróun lyfja. Við erum traustur samstarfsaðili fyrir viðskiptavini í lyfjaiðnaðinum, skuldbundið sig til að veita Cuting - Edge Solutions fyrir ekki - klínískar rannsóknir.