Epatociti primari: uno strumento cruciale per l'avanzamento della ricerca sui farmaci in vitro non -

Epatociti primari: uno strumento cruciale per l'avanzamento della ricerca sui farmaci in vitro non -

Il fegato, come organo primario per l'esposizione ai farmaci, svolge un ruolo cruciale nel metabolismo dei farmaci e nei processi di tossicità. Gli epatociti primari possiedono l'intero spettro delle caratteristiche cellulari e dei livelli fisiologici di enzimi e cofattori, inclusi enzimi legati alla membrana - come il citocromo p450 (una funzione miscelata - ossidasi nel reticolo endoplasmatico liscio) Per questo motivo, gli epatociti primari sono ampiamente considerati come il gold standard per la costruzione di modelli epatici in vitro e sono favoriti dai ricercatori nell'interazione farmacologica, nel metabolismo dei farmaci e negli studi di tossicità. Questo articolo fornisce una panoramica dei modelli di cultura 2D e 3D basati su epatociti primari e le loro applicazioni nello sviluppo di farmaci.

Parole chiave: epatociti primari, coltivazione 2D, coltivazione 3D, organoidi, co - cultura.

1. 1. Isolamento degli epatociti primari

L'isolamento degli epatociti primari è un passo fondamentale per stabilire modelli epatici in vitro, con il metodo di perfusione di collagenasi a due fasi che è il più comunemente usato. Negli animali più piccoli, la perfusione epatica può essere eseguita attraverso la vena portale o la vena cava inferiore, mentre gli animali più grandi richiedono in genere perfusione attraverso lobi e segmenti epatici. Diversi fattori chiave influenzano il successo dell'isolamento degli epatociti: in primo luogo, la collagenasi dovrebbe essere non - citotossica. In secondo luogo, i tempi della digestione sono cruciali—Sia sotto - digestione che oltre - digestione può compromettere la resa e la vitalità degli epatociti. In terzo luogo, la condizione epatica deve essere ottimale, poiché gli epatociti sono altamente sensibili al danno ischemico. Il fegato usato per la preparazione degli epatociti dovrebbe essere rapidamente raffreddato per ridurre i tassi metabolici e prevenire l'ipossia metabolica e la successiva ischemia.

Gli standard per gli epatociti primari utilizzati nella ricerca sui farmaci sono i seguenti:

1. 2. Cultura 2D di epatociti primari

Il modello di epatociti a sospensione

Contiene farmaci completi - enzimi e cofattori metabolizzanti, rendendolo adatto per lo studio di vari percorsi di clearance metabolici. Tuttavia, la vitalità degli epatociti della sospensione e l'attività degli enzimi metabolizzanti del farmaco - diminuiscono gradualmente all'aumentare del tempo di incubazione in vitro, limitando il tempo di incubazione a un massimo di 4 ore. Questo modello viene in genere utilizzato per stimare la clearance dei farmaci con tassi di autorizzazione da moderati a alti. Quando il tasso di autorizzazione è inferiore al 20%, non è possibile determinare valori di autorizzazione accurati. Gli epatociti a sospensione tradizionali - Modelli di metabolismo in vitro sono insufficienti per generare reazioni metaboliche rilevabili per i composti lenti - Un metodo di relè di epatociti a sospensione (Figura 1) può essere utilizzato per estendere il tempo di incubazione a 20 ore o anche più a lungo.

Applicazione:Attività enzimatica e studi di stabilità metabolica per farmaci a piccole molecole.

Figura 1. Processo di trasferimento del metodo del relè di epatociti sospensione

Fonte: Drug Metab Dept, 2012,40 (9): 1860–1865

Il modello di epatociti altattibili

Gli epatociti primari sono coltivati ​​in un sistema 2D su piastre di coltura rivestite di collagene - Gli epatociti presentano una morfologia epiteliale, con nuclei sporgenti, che spesso si presentano in una forma binucleata. Gli svantaggi della coltura monostrato di singoli epatociti includono: 1. Alterazione della polarità e della funzione cellulare.2. Mancanza di altri tipi di cellule rilevanti (cioè cellule non - parenchimale) necessarie per la normale funzione.3. Incapacità di fornire sufficienti nutrienti e fattori paracrini per supportare gli epatociti nell'esecuzione delle loro funzioni (come l'acido biliare e la biosintesi delle proteine ​​sieriche).

Applicazioni:

1). Valutazione delle interazioni farmacologiche -Ciò include l'induzione enzimatica, l'inibizione degli enzimi e gli studi di trasportatore. In primo luogo, quando un farmaco funge da induttore, può portare ad una maggiore espressione di enzimi e trasportatori metabolizzanti del farmaco. Induttori forti possono sovraregolare contemporaneamente più geni, come l'induzione fenobarbitale di CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT e diverse proteine ​​di trasporto come MRP2. In secondo luogo, ci sono specie - Differenze specifiche nel modo in cui gli epatociti rispondono agli induttori. Ad esempio, la rifampicina è un induttore efficace per gli epatociti umani e di coniglio, ma non ha alcun effetto di induzione sugli epatociti di ratto. Infine, la densità di placcatura non ottimale di epatociti altattibili può portare a una ridotta espressione basale di P450 e risposte a induzione artificialmente aumentate. Come mostrato nella Figura 3, gli epatociti a densità di placcatura più basse mostrano una minore attività basale di CYP1A2, CYP2B6 e CYP3A4, ma risposte di induzione più forti. Pertanto, sono necessari epatociti sani a una densità di placcatura appropriata per ottenere dati fisiologicamente rilevanti.

Figura 2. Relazione tra densità di placcatura di epatociti umani crioconserici e induzione enzimatica

Fonte: Current Drug Discovery Technologies, 2010, 7: 188 - 198

2). Valutazione dell'epatotossicità: Osservando i cambiamenti morfologici sotto un microscopio ottico, come la morfologia cellulare, l'aggregazione del vacuolo e delle gocce lipidiche e l'attaccamento/distacco cellulare. Rilevazione di necrosi epatocitaria (come indicato dall'aspartato aminotransferasi, lattato deidrogenasi e alanina aminotransferasi) e apoptosi (frammentazione del DNA). Per la citotossicità mediata da citochina, le colture monostrato singoli di epatociti non possono prevedere risposte tossiche a causa della regolazione da parte delle sostanze rilasciate dalle cellule non - parenchimali vicine, come cellule Kupffer, cellule stellate e cellule endoteliali sinusoidali.

3). "Metodo relè" per lo studio della clearance composta metabolizzante lenta e dei suoi metaboliti: L'attività dei farmaci - enzimi metabolizzanti negli epatociti piaciuti inizia a diminuire dopo 24 ore di placcatura. Dopo aver incubabile epatociti al piaga con mezzo di siero - libero contenente il composto di interesse per 24 ore, il mezzo viene raccolto e miscelato, quindi trasferito a nuovi epatociti plattali per ulteriori studi (Figura 3).

Figura 3. Processo di trasferimento del metodo relè di epatociti plateabili

Fonte: Lettere di metabolismo dei farmaci, 2016, 10: 3 - 15

3). Valuta l'assorbimento cellulare, l'endocitosi, la fuga endosomiale e gli effetti di silenziamento sul gene bersaglio degli epatociti - piccoli farmaci acidi nucleici mirati.

Modello di coltivazione sandwich

In vitro, gli epatociti possono essere coltivati ​​tra due strati di collagene o Matrigel per ricostruire strutture in vivo, note come coltivazione sandwich. Gli epatociti coltivati ​​tra due strati di gel - collagene (struttura sandwich) possono migliorare la morfologia e la vitalità delle cellule e mantenere la loro funzionalità per un periodo più lungo. Inoltre, gli epatociti nella coltura sandwich possono ripristinare la polarità, consentendo una corretta localizzazione dei trasportatori basolaterali e canalicolari, nonché la formazione di reti di dotti biliari funzionali (Figura 4).

Figura 4. Espressione polarizzata dei trasportatori nel modello di sandwich per epatociti umani

Fonte: Current Drug Discovery Technologies, 2010, 7, 188 - 198

Applicazioni:

1. 1). Stima dell'escrezione biliare di composti.
2. 2). Valutazione della distribuzione epatica e biliare di composti e metaboliti endogeni ed esogeni.
3. 3). Stima della clearance mediata dal metabolismo e dai trasportatori e dalla costruzione di modelli farmacocinetici basati sulla fisiologia.
4. 4). Studiare l'epatotossicità e fornire meccanismi per le lesioni epatiche indotte da farmaci clinici. I dati sono integrati nei modelli di farmacologia dei sistemi per prevedere potenziali droghe indotte da farmaci nell'uomo.
5.  
   1. 3. Cultura 3D di epatociti primari

6. Nei sistemi di cultura 3D, gli epatociti sono coltivati ​​in una matrice a tre - dimensionali, che imita meglio l'architettura epatica in vivo rispetto alle culture monostrato 2D. Questi sistemi promuovono interazioni cellulari - cellula e cellula - matrice, che possono ripristinare più funzioni fisiologiche del fegato, tra cui il metabolismo dei farmaci, la secrezione proteica e la formazione biliare. Le colture 3D di epatociti primari possono essere utilizzate per studiare il fegato - Funzioni specifiche in un ambiente più in vivo - come l'ambiente, offrendo vantaggi per i test antidroga, la valutazione della tossicità e la modellizzazione della malattia.

   Modello di sferoide

Attraverso tecniche come la coltura di attaccamento ultra - bassa, la coltura di caduta sospesa e la coltura di cellule magnetiche (Figura 5), ​​gli epatociti primari possono aggregarsi in aggregati sferoidali con un diametro fino a 150 - 175 µm senza fare affidamento su matrici esterne. Un vantaggio della coltura sferoide è che ogni sferoide richiede solo 1.330 - 2.000 cellule, riducendo significativamente il numero di cellule rispetto ad altre tecniche di coltura 3D. Studi recenti hanno dimostrato che le colture di sferoidi dell'epatocita primaria possono sostenere fino a 5 settimane, con l'attività degli enzimi del CYP che rimane quasi invariata tra il giorno 8 e il giorno 35. L'analisi della proteomica ha rivelato che, rispetto alla cultura sandwich, gli enzimi responsabili dell'assorbimento di droghe, della distribuzione, della distribuzione, del metabolismo ed escrezione sono meglio preservati per 14 giorni nella cultura sfereide. Tuttavia, il fegato è molto più complesso di un aggregato cellulare. Il lato basolaterale degli epatociti interagisce con il sangue, mentre la bile fluisce dal lato apicale, che è una caratteristica chiave della complessa struttura del lobulo epatico, e questo non può ancora essere replicato nel modello sferoide.

Applicazioni:

1. 1). Studio della clearance composta metabolizzante lenta e dei suoi metaboliti.
2. 2). Ricerca sull'epatotossicità.
3. 3). Valutazione dell'assorbimento cellulare, dell'endocitosi, della fuga endosomiale e degli effetti di silenziamento sui geni bersaglio degli epatociti - piccoli farmaci acidi nucleici mirati.

Figura 5. Metodo di coltura sferoide

Modello di organoidi epatici

La definizione di consenso degli organoidi è: strutture 3D derivate da cellule staminali, cellule progenitrici o cellule differenziate, in grado di riprodurre alcune funzioni e strutture del tessuto nativo in vitro, imitando efficacemente il microambiente in vivo e le interazioni cellulari - Gli organoidi epatici sono stati identificati come il modello più avanzato per la ricerca sulla biologia epatica umana.

Fonti cellulari per la costruzione organoide epatica:

① cellule staminali pluripotenti (PSC):

Le cellule staminali embrionali (ESC) e le cellule staminali pluripotenti indotte (IPSC) possiedono elevata pluripotenza, plasticità e capacità proliferativa illimitata. Sotto l'influenza di specifici fattori di segnalazione, si differenziano in cellule come epatociti - con attività e funzione. Tuttavia, gli organoidi epatici derivati ​​da PSC possono sottoporsi a alterazioni epigenetiche e genetiche, esibendo cambiamenti di aneuploidia cromosomica durante l'amplificazione.

Applicazioni:

1. 1). Modelli di malattie del fegato genetico
2. 2). Modelli infettivi per la malattia epatica
3. 3). Test di citotossicità del farmaco

② Tissuta epatica - Cellule derivate: queste includono colangiociti ed epatociti. Gli epatociti maturi mantengono il potenziale delle cellule staminali e la capacità proliferativa in ambienti specifici. Rispetto agli organoidi derivati ​​da PSC -, gli organoidi derivati ​​dal tessuto primario sono più maturi, con genomi più stabili e mantengono la stabilità fenotipica e genetica durante la coltura lunga in vitro. Tuttavia, la capacità proliferativa a lungo termine degli organoidi di epatociti umani maturi è limitato rispetto agli epatociti umani fetali o agli epatociti primari di topo per adulti. La coltivazione di organoidi per gli epatociti adulti rimane impegnativa.

Metodo di coltura (Figura 6): il tessuto epatico viene digerito in singole cellule e una miscela di matrigel e cellule viene seminata in una piastra 24 - Well per formare strutture a forma di cupola. Incubare in un incubatore di coltura cellulare (37 ° C) per 15 minuti. Dopo la solidificazione, aggiungere un terreno di coltura specifico. Passaggio dopo circa 14 giorni. Sostituire il mezzo originale con mezzo di differenziazione dopo 7 - 10 giorni.

Applicazioni:

1. 1). Modelli di epatotossicità
2. 2). Studi sul disturbo del metabolismo in vitro
3. 3). Malattia epatica grassa non -
4. 4). Sviluppo di farmaci per malattie epatiche benigne e maligne

Figura 6. Cultura e passaggio del tessuto - organoidi epatici derivati

Fonte: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

Confronto tra cultura sferoide e cultura organoide

4. Modello di coltura di epatociti primari

1. 1. Modello di coltura di epatociti primari 2D
      

      Nel modello di coltura di epatociti primari 2D, due o più diversi tipi di cellule vengono miscelati e coltivati ​​in un ambiente due - dimensionali. La caratteristica chiave di questo modello è l'interazione diretta tra diversi tipi di cellule, l'interazione tra le cellule e la matrice extracellulare o la trasmissione del segnale indiretto tramite citochine e comunicazioni chimiche. Le funzioni primarie per gli epatociti, come la produzione di albumina e la capacità del metabolismo dei farmaci, possono essere mantenute per un massimo di tre settimane.

      Applicazioni:

      1. 1). Epatociti primari Co
      2. 2). Epatociti primari Co - coltivati ​​con cellule epatiche non - parenchimali (ad es. Cellule stellate, cellule endoteliali sinusoidali): questo modello è utile per la ricerca di droghe e lesioni epatiche indotte da farmaci (dili), in quanto aiuta a studiare il ruolo delle citochine, delle chemochine e dei fattori di crescita nel modulare le risposte di adattamento al droga.
      3. 3). Epatociti primari CO - coltivato con cellule T: questo modello viene utilizzato per rilevare il metabolismo dei farmaci epatici - Risposte specifiche delle cellule T.
      4. 4). Hepatomax ™ di IphaseCO - Culture System: Iphase ha sviluppato un sistema di coltura CO -™. Co - coltivando epatociti primari umani con cellule stromali, è possibile mantenere un buon farmaco - l'attività degli enzimi metabolizzanti negli epatociti umani per un massimo di 3 settimane. Questo sistema è adatto per lo studio di tassi di autorizzazione composti lenta - metabolizzanti e i loro metaboliti.

      Questo modello di coltura fornisce una piattaforma più fisiologicamente rilevante per valutare il metabolismo dei farmaci, la tossicità e i processi di malattia correlati e fegato, offrendo approfondimenti su come i diversi tipi di cellule contribuiscono alla funzione epatica e alle malattie.
      
      

      Modello di coltura di epatociti primari 3D

      Direct 3d Co - Culture: Questo modello prevede la miscelazione di due o più diversi tipi di cellule epatiche (ad es. Epatociti primari, cellule endoteliali sinusoidali, cellule stellate epatiche, cellule di Kupffer) per formare sferoidi auto assemblati o coltivarle in un ambiente 3D costruito con materiali come collagene, fibrina, algina o idrogli. La coltura 3D diretta di CO - consente una stretta interazione tra diverse cellule epatiche attraverso meccanismi come l'adesione cellulare - a - cellulare, la segnalazione di paracrina tramite citochine solubili e l'adesione della matrice extracellulare, consentendo la comunicazione tra epatociti.

      Applicazioni:

      1. 1). Modello di fibrosi epatica: utilizzato per studiare i meccanismi e la progressione della fibrosi epatica.
      2. 2). Drug - Modello di lesione epatica indotta (dili): aiuta a simulare e valutare il danno epatico causato dai farmaci.
      3. 3). Interazioni farmacologiche, metabolismo dei farmaci e induzione enzimatica: valuta come i diversi farmaci interagiscono, come vengono metabolizzati e come inducono enzimi epatici.

      Cultura 3D indiretta 3D: Questo metodo utilizza un sistema di separazione fisica (ad es. Transwell o altri materiali) per coltivare due o più tipi di cellule (come gli epatociti primari con cellule NIH/3T3 o cellule endoteliali sinusoidali) in un ambiente 3D, dove viene impedito il contatto cellulare diretto - a - cellulare. La comunicazione tra le cellule si verifica tramite citochine solubili.

      Applicazioni:
      Utilizzato per studiare la comunicazione non - contatto tra cellule epatiche nel corpo.

      
      In sintesi, Iphase, come leader nella ricerca biologica in vitro, fornisce soluzioni complete per i test farmacologici non - Dall'isolamento e nella cultura degli epatociti primari da varie specie allo sviluppo di prodotti di supporto come terreni di coltura per applicazioni specifiche o piastre rivestite con collagene multi - Siamo un partner di fiducia per i clienti nel settore farmaceutico, impegnati a fornire soluzioni di taglio - bordo per la ricerca non -