שבר S9 של כבד עכברוש הושרה: מערכת הפעלה מטבולית לבדיקות גנוטוקסיות ומוטציה חוץ גופית ומוטציה

מילות מפתח: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, מבחן מוטציה, גנוטוקסיות, רעילות גנטית, כבד עכברוש S9, מבחן AMES, בדיקת מיני איימס, סטייה כרומוזומלית, מיקרו -גרוס, HPRT/HGPRT Assay, TK Assays, TK, assay, TK, assay, TK, assay assay, askd, hprtrt assay assay, askd, ascay, ascdd .7

מוצר iphase

מָבוֹא

כבד עכברוש המושרה S9הוא מרכיב מרכזי בהערכת ה-רעילות גנטיתפוטנציאל של כימיקלים, במיוחד בטוקסיקולוגיה רגולטורית. הוא משמש בדרך כלל בשילוב עם מבחני חוץ גופית, כמומבחן איימס וכןבדיקות מוטציה, כדי להעריך את התכונות המוטגניות של תרכובות. על ידי מתן מערכת אנזימטית העשירה בציטוכרום P450 (CYP450), שבריר כבד החולדה S9 המושרה ממלא תפקיד מכריע בהדמיה של התהליכים המטבוליים המתרחשים בכבד, ועוזר לקבוע אם כימיקלים יכולים לגרום למוטציות גנטיות או לסרטן.

כבד עכברוש המושרה S9

שבר S9 של הכבד מתייחס לפוסט - סופר -נפט מיטוכונדריאלי המתקבל מהומוגניטים של כבד חולדה לאחר סדרה של שלבי צנטריפוגה. המונח "המושרה" מתייחס לטיפול בחולדות עם תרכובות ספציפיות המשפרות את פעילותם של אנזימי הכבד, ובמיוחד את האנזימים הציטוכרום P450 (CYP450), האחראים למטבוליזם של מגוון רחב של קסנו -ביוטיקה.

שבר S9 של כבד החולדה המושרה מכיל מגוון אנזימים המעורבים במטבוליזם שלב I ובשלב II של כימיקלים. זה כולל אנזימים כמו ציטוכרום P450 מונוקסיגנזות, המאפשרים ביו -טרנספורמציה חמצונית של מצעים, ובכך מחקים את חילוף החומרים בכבד האנושי.

פעילות CYP450 והפעלה מטבולית

משפחת האנזים הציטוכרום P450 (CYP450) ממלאת תפקיד מרכזי במטבוליזם של מגוון רחב של חומרים, כולל תרופות רבות, כימיקלים סביבתיים ומסרטנים. שבר S9 של כבד החולדה המושרה מכיל אנזימים אלה והוא חיוני להערכת כימיקלים שעשויים להפוך לגנוטוקסיים לאחר ההפעלה המטבולית.

תרכובות רבות אינן רעילות בתחילה אך יכולות להיות רעילות לאחר חילוף החומרים בכבד. מוטגנים Pro - אלה (הדורשים הפעלה מטבולית כדי להפוך למוטגנית) ו- Pro - Carcinogens (הדורשים הפעלה כדי לגרום לסרטן) ניתן לאתר רק באמצעות מבחנים הכוללים מערכת הפעלה מטבולית של S9. ללא אינדוקציה של אנזימים מטבוליים כמו CYP450, נראה כי חומרים אלה אינם מזיקים בבדיקות גנוטוקסיות סטנדרטיות.

על ידי הוספת כבד עכברוש המושרה S9 למבחני חוץ גופית, החוקרים יכולים להעריך כיצד חומר מתקשר עם אנזימי CYP450. זה חשוב במיוחד עבור תרופות, שכן חילוף החומרים על ידי אנזימים של CYP450 הוא צעד קריטי בפרמקוקינטיקה של תרופות רבות.

יישומים של כבד עכברוש המושרה S9

1. 1. מבחן איימס (OECD 471)

מבחן איימס, המתואר בהנחיהOECD 471, הוא אחת השיטות הכי ידועות והשימוש נרחב להערכת מוטגניות. זה כרוך בחשיפת זנים של חיידקי סלמונלה לכימיקלים לבדיקה כדי לבדוק אם זה גורם למוטציות הגורמות לחיידקים לחזור למצב עצמאי של היסטידין.

כדי לדמות את התהליך המטבולי האנושי, לרוב מתווסף כבד עכברוש S9 המושרה למערכת הבדיקה. שבר S9 מספק את האנזימים הנדרשים, כולל CYP450, אשר עשוי להידרש לחילוף חומרים של התרכובת לצורה תגובית יותר העלולה לגרום למוטציות ב- DNA החיידקי. שילוב זה של S9 עם מבחן AMES מאפשר הערכה מקיפה יותר של הפוטנציאל המוטגני על ידי חיקוי מנגנונים מוטגניים ישירים ומופעלים מטבוליים.

2. 2.בדיקות מוטציה (בדיקת סטייה כרומוזומלית, בדיקת מיקרו -גרוס, ומבחני חוץ גופ אחרים)

בנוסף לבדיקת AMES, בדיקות מוטציה משמשות לרוב כדי להעריך את הפוטנציאל הגנוטוקסי של כימיקלים. בדיקות אלה מקיפות יותר בהערכת מגוון של נזק גנטי, כולל מוטציות כרומוזומליות, מוטציות גנים והיווצרות מיקרו -גרעינים. כבד עכברוש המושרה S9 משמש בבדיקות מוטציה מהסיבות הבאות:

מבחן MicroNucleus (OECD 487)

בדיקה זו מגלה היווצרות של מיקרו -גרעינים בתאים, שהם גופים קטנים וחוץ -גרעיניים המכילים שברי כרומוזומים או כרומוזומים שלמים שלא שולבו בגרעין במהלך חלוקת התא. THE מבחן מיקרו -גרוסיכול לאתר קלאסטוגני (כרומוזום - שבירה) ואנאוגני (השפעה על מספר הכרומוזום). כבד עכברוש המושרה S9 משמש כאן להפעלת חומר הבדיקה מטבולית, מכיוון שחלק מהכימיקלים גורמים רק לנזק כרומוזומלי לאחר חילוף החומרים על ידי אנזימי כבד. שבר S9 משפר את הרגישות של הבדיקה על ידי הדמיה של ההפעלה המטבולית שעלולה להתרחש in vivo.

מבחן סטייה כרומוזומלית (OECD 473)

בדיקה זו מעריכה אם חומר עלול לגרום נזק מבני לכרומוזומים על ידי גרימת הפסקות, מחיקות, טרנסלוקציות או סוגים אחרים של סטיות. כמו מבחן המיקרו -גרוס, המבחן סטייה כרומוזומליתניתן ליישם עם או בלי הפעלה מטבולית. כבד עכברוש המושרה S9 מתווסף למערכת הבדיקה כדי לחקות את התהליכים המטבוליים בכבד, ומאפשר הערכת חומרים שעלולים לא לגרום לנזק כרומוזומלי בצורתם המקורית אך עלולים לעשות זאת לאחר חילוף החומרים בכבד.

טבלה 1. שיקולים השוואתיים של בדיקות מוטציה

מבחן HPRT/HGPRT (OECD 476)

במבחן HPRT/HGPRT, תרבויות של אוגר סיני (CHO או V79) או תאי לימפובלסטואידים אנושיים (TK6) נחשפים לכימיקלים לבדיקה בנוכחות תערובת מטבולית של כבד חולדה המושרה, המספקת אנזימים של CYP450 הנדרשים להמרת פרו -מוטגנים למינים תגובת DNA. לאחר טיפול קצר ותקופת ביטוי של שבעה ימים, תאים מאתגרים עם 6 -thioguanine; רק שיבוטים הנושאים מוטציות של אובדן פונקציה בגן ההיפוקסנטין -גואנין פוספוריבוזילטרנספרז שורדים. על ידי השוואה בין ספירת מושבות מוטציה לכדאיות הכללית, החוקרים קובעים תדירות מוטציה, שאם הם מוגבהים בשחזור על פני ביקורת במקביל והיסטורי, מעיד על פוטנציאל גנוטוקסי.

מבחני TK (OECD 490 & OECD 476)

THEמבחן TK מעסיק תאי לימפומה של L5178Y לעכבר (OECD 490) או בתאי CHO (OECD 476) הנדסה הטרוזיגוזית במתחם התימידין קינאז. בעקבות חשיפה כימית ± S9 תערובת, התאים מתאוששים ומצופים במדיום המכיל טריפלואורוטימידין, ההורג תאים חסרי רווח TK. מוטציות TK⁻ שורדות מושבות במשך 10-14 יום, כאשר מוטציות בקולוניה קטנה משקפות לעתים קרובות אירועים כרומוזומליים ומוטציות בקולוניה גדולה המשקפות מוטציות נקודתיות. כמו במבחן HPRT/HGPRT, בקרות ציטוטוקסיות מחמירות ומדדי מוטגן חיוביים מבטיחים כי עלייה נצפית בתדירות המוטציה משקפת באופן אמין את הסיכון הגנוטוקסי של התרכובת.

4. 4. הערכת סיכוני סרטן

כבד עכברוש מושרש S9 משמש גם במחקרים שמטרתם להעריך את הסרטן - לגרום לפוטנציאל של חומרים. על ידי הדמיה של התהליכים המטבוליים המתרחשים בכבד האנושי, שבר S9 יכול לעזור בזיהוי תרכובות העלולות להוביל להיווצרות מטבוליטים תגוביים המסוגלים לקשור ל- DNA ולגרום למוטציות העלולות להוביל לסרטן.

מבחן איימס משופר עם כבד אוגר מושרש S9

על פי ההנחיות האחרונות שהונפקה על ידי סוכנות התרופות האירופיות (EMA), מבחן ה- AMES המסורתי עשוי להיות לא רגיש מספיק כדי לאתר את הפוטנציאל המוטגני של זיהומים מסוימים של n - nitrosamine, במיוחד n - nitrosodimethylamine (NDMA), בין היתר. לפיכך הומלץ במבחן ה- AMES המשופר, שפותח על ידי המרכז הלאומי למחקר טוקסיקולוגי (NCTR), חלוקה של מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) כאלטרנטיבה אמינה יותר. בדיקת ה- AMES המשופרת הציגה הוספה של כבד האוגר S9 של אוגר המושרה, שביצעה מכילה של 30% כבד חולדה S9 ו- 30% כבד האוגר S9. יש להכין סופר -נפטרים דסמוסומליים של עכברוש ואוגר (S9S) מכבדי מכרסמים המטופלים באנזים ציטוכרום P450 - מעוררים חומרים. על ידי שימוש בכבד האוגר המושרה S9, בדיקה משופרת זו מדמה טוב יותר את חילוף החומרים האנושי ומגדילה את אמינות התוצאות.

מַסְקָנָה

כבד עכברוש S9 משמש ככלי קריטי בבדיקת גנוטוקסיות, ומסייע לחוקרים וסוכנויות רגולטוריות להעריך את הפוטנציאל המוטגני והסרטן של כימיקלים. על ידי מתן מערכת הפעלה מטבולית, היא משפרת את היכולת של מבחנים כמו בדיקת AMES, בדיקות מוטציה ומחקרי פעילות CYP450 כדי לאתר חומרים הדורשים הפעלה מטבולית כדי להפוך לגנוטוקסי. יישומיה חיוניים להבטיח את בטיחותם של תרופות, כימיקלים ומוצרי צריכה חדשים. עם תפקידו בהדמיה של חילוף החומרים בכבד האנושי, שבר S9 של כבד החולדה המושרה ממשיך להיות חלק חיוני מהערכות הרעלים והבטיחות הרגולטורית המודרנית.