הפטוציטים ראשוניים: כלי מכריע לקידום מחקרי תרופות חוץ גופיות שאינן קליניות

הפטוציטים ראשוניים: כלי מכריע לקידום מחקרי תרופות חוץ גופיות שאינן קליניות

הכבד, כאיבר העיקרי לחשיפה לתרופות, ממלא תפקיד מכריע בתהליכי חילוף החומרים והרעילות של התרופות. הפטוציטים הראשוניים הם בעלי הספקטרום המלא של מאפייני התא ורמות פיזיולוגיות של אנזימים וקופקטורים, כולל אנזימים כבולים כמו ציטוכרום P450 (תפקוד אוקסידאז מעורב באנדופלזמה חלקים שנמצאים באנדופלזמה) ואסטרז ציטוזולי,, אוסטרס המוצא כלפי האנדופלזמה. מסיבה זו, הפטוציטים הראשוניים נחשבים לרבים כסטנדרט הזהב לבניית מודלים בכבד חוץ -גופיים ומועדפים על ידי חוקרים באינטראקציה בין תרופות, חילוף חומרים תרופתי ומחקרי רעילות. מאמר זה מספק סקירה של מודלים של תרבות דו -ממדית ותלת -ממדית המבוססים על הפטוציטים ראשוניים ויישומיהם בפיתוח תרופות.

מילות מפתח: הפטוציטים ראשוניים, טיפוח דו -מימדי, טיפוח תלת מימד, אורגנואידים, CO - תרבות.

1. 1. בידוד הפטוציטים הראשוניים

הבידוד של הפטוציטים הראשוניים הוא צעד קריטי בהקמת דגמי כבד חוץ -גופיים, כאשר שני שיטת זלוף הקולגןאז שלב היא הנפוצה ביותר. בבעלי חיים קטנים יותר, ניתן לבצע זלוף בכבד דרך וריד הפורטל או Vena Cava נחות, ואילו בדרך כלל בעלי חיים גדולים יותר דורשים זלוף דרך אונות או קטעי כבד. מספר גורמים מרכזיים משפיעים על הבידוד המוצלח של הפטוציטים: ראשית, קולגןאז צריך להיות לא ציטוטוקסי. שנית, עיתוי העיכול הוא קריטי -שניהם מתחת לעיכול וגם מעל - עיכול יכול לפגוע בתשואת הפטוציטים וכדאיות. שלישית, מצב הכבד חייב להיות אופטימלי, מכיוון שהפטוציטים רגישים מאוד לנזק איסכמי. יש לקרר במהירות את הכבד המשמש להכנת הפטוציטים כדי להפחית את שיעורי חילוף החומרים ולמנוע היפוקסיה מטבולית ואיסכמיה שלאחר מכן.

הסטנדרטים להפטוציטים ראשוניים המשמשים במחקר תרופות הם כדלקמן:

1. 2. תרבות 2D ראשונית של הפטוציטים

מודל ההפטוציטים של ההשעיה

הוא מכיל תרופה מלאה - חילוף חומרים אנזימים וקופקטורים, מה שהופך אותה מתאימה לחקר מסלולי פינוי מטבוליים שונים. עם זאת, הכדאיות של ההשעיה הפטוציטים ופעילות אנזימים מטבוליזציה של תרופה יורדים בהדרגה ככל שזמן הדגירה במבחנה גדל, מה שמגביל את זמן הדגירה למקסימום 4 שעות. מודל זה משמש בדרך כלל כדי להעריך את פינוי התרופות עם שיעורי אישור בינוני עד גבוה. כאשר שיעור הסילוק הוא פחות מ- 20%, לא ניתן לקבוע ערכי פינוי מדויקים. הפטוציט ההשעיה המסורתי - מבוסס מודלים של חילוף חוץ חוץ גופית אינם מספיקים ליצירת תגובות מטבוליות הניתנות לגילוי לתרכובות מטבוליזציה איטיות, ובכך להגביל את יכולתם לחזות את שיעורי הסילוק ואת התוצרים המטבוליים של תרכובות אלה. ניתן להשתמש בשיטת ממסר הפטוציטים בהשעיה (איור 1) כדי להאריך את זמן הדגירה ל 20 שעות ואף יותר.

בַּקָשָׁה:פעילות אנזים ומחקרי יציבות מטבולית לתרופות מולקולות קטנות.

איור 1 איור 1. השעיה

מקור: Dispos Metab Dispos, 2012,40 (9): 1860–1865

מודל ההפטוציטים הניתנים לשטח

הפטוציטים הראשוניים מתורבתים במערכת דו מימדית על צלחות תרבות מצופות קולגן. ההפטוציטים מציגים מורפולוגיה של אפיתל, עם גרעינים בולטים, המוצגים לעתים קרובות בצורה דו -דתית. החסרונות של תרבות חד -שכבית של הפטוציטים יחידה כוללים: 1. שינוי קוטביות תאים ותפקוד .2. היעדר סוגי תאים רלוונטיים אחרים (כלומר, תאים parenchymal שאינם -) הנדרשים לתפקוד רגיל .3. חוסר יכולת לספק חומרים מזינים מספיקים וגורמי פרצרין כדי לתמוך בהפטוציטים בביצוע תפקודיהם (כמו חומצת מרה וביוסינתזה של חלבון בסרום).

יישומים:

1). הערכת תרופות - אינטראקציות תרופות:זה כולל אינדוקציה של אנזים, עיכוב אנזים ומחקרי טרנספורטר. ראשית, כאשר תרופה פועלת כמעוררת, היא יכולה להוביל לביטוי מוגבר של תרופה - חילוף חומרים של אנזימים ומובילים. מעוררים חזקים יכולים לווסת גנים מרובים בו זמנית, כמו אינדוקציה פנובארביטלית של CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT וכמה חלבוני תחבורה כמו MRP2. שנית, ישנם מינים - הבדלים ספציפיים באופן האופן בו הפטוציטים מגיבים למעוררים. לדוגמה, ריפמפיצין הוא גורם יעיל להפטוציטים אנושיים וארנביים, אך אין לו השפעה של אינדוקציה על הפטוציטים של חולדה. לבסוף, צפיפות ציפוי תת -אופטימלית של הפטוציטים הניתנים להחלפה עשויה להוביל לביטוי בסיסי מופחת של P450s ולתגובות אינדוקציה מוגברת באופן מלאכותי. כפי שמוצג באיור 3, הפטוציטים בצפיפות ציפוי נמוכה יותר מראים פעילות בסיסית נמוכה יותר של CYP1A2, CYP2B6 ו- CYP3A4, אך תגובות אינדוקציה חזקות יותר. לפיכך, הפטוציטים בריאים בצפיפות ציפוי מתאימה נחוצים כדי להשיג נתונים רלוונטיים פיזיולוגית.

איור 2. הקשר בין צפיפות ציפוי של הפטוציטים אנושיים עם קריאה -שמורים לבין אינדוקציה של אנזים

מקור: טכנולוגיות גילוי תרופות נוכחיות, 2010, 7: 188 - 198

2). הערכת רעילות הפטוטו: התבוננות בשינויים מורפולוגיים תחת מיקרוסקופ אור, כמו מורפולוגיה של תאים, צבירה של טיפות שומנים וטיפות שומנים, והתקשרות/ניתוק תאים. איתור נמק הפטוציטים (כפי שמצביע על ידי אמינוטרנספרז אספרטט, לקטט דה -הידרוגנז ואלנין אמינוטרנספרז) ואפופטוזיס (פיצול DNA). עבור ציטוקין - ציטוטוקסיות מתווכת, תרבויות חד -שכביות יחיד של הפטוציטים אינן יכולות לחזות תגובות רעילות בגלל הסדיות על ידי חומרים ששוחררו מתאים פרנכימליים שאינם -

3). "שיטת ממסר" לחקר חילוף חומרים איטי של פינוי מורכב ומטבוליטים שלו: הפעילות של תרופה - אנזימים מטבוליזציה בהפטוציטים הניתנים להחלפה מתחילה לרדת לאחר 24 שעות ציפוי. לאחר דגירת הפטוציטים הניתנים להחלפה עם סרום - מדיום חופשי המכיל את תרכובת העניין במשך 24 שעות, המדיום נאסף ומעורב, ואז מועבר להפטוציטים חדשים הניתנים להחלפה למחקר נוסף (איור 3).

איור 3. איור 3. תהליך העברת שיטת ממסר הפטוציטים

מקור: מכתבי חילוף חומרים סמים, 2016, 10: 3 - 15

3). הערך את ספיגת הסלולר, האנדוציטוזיס, הבריחה האנדוזומלית והשתקת על גן המטרה של תרופות חומצות גרעין קטנות ממוקדות.

מודל טיפוח כריך

במבחנה, ניתן לתרבות הפטוציטים בין שתי שכבות של קולגן או מטריגל כדי לשחזר מבנים vivo, המכונה גידול כריך. הפטוציטים שעובדו בין שתי שכבות של ג'ל - קולגן (מבנה כריך) יכולים לשפר את המורפולוגיה והכדאיות של התאים, ולשמור על הפונקציונליות שלהם במשך תקופה ארוכה יותר. יתר על כן, הפטוציטים בתרבות הכריך יכולים להחזיר את הקוטביות, מה שמאפשר לוקליזציה נאותה של הובלות בסיסיות ותעלות, כמו גם היווצרות רשתות צינורות מרה פונקציונליות (איור 4).

איור 4. ביטוי מקוטב של הובלות במודל כריך הפטוציט האנושי

מקור: טכנולוגיות גילוי תרופות נוכחיות, 2010, 7, 188 - 198

יישומים:

1. 1). הערכת הפרשת המרה של תרכובות.
2. 2). הערכת התפלגות הכבד והשרה של תרכובות ומטבוליטים אנדוגניים ואקסוגניים.
3. 3). הערכת פינוי בתיווך מטבוליזם ומובילים, ובניית מודלים פרמקוקינטיים מבוססי פיזיולוגיה.
4. 4). חקר רעילות כבד ומתן מנגנונים לתרופה קלינית - פגיעה בכבד הנגרמת. הנתונים משולבים במודלים של מערכות פרמקולוגיה כדי לחזות תרופה פוטנציאלית - פגיעה בכבד הנגרמת בבני אדם.
5.  
   1. 3. תרבות התלת מימד הראשונית של הפטוציטים

6. במערכות תרבות תלת מימד, הפטוציטים מתורבתים במטריקס תלת מימדי, המחקה טוב יותר את ארכיטקטורת הכבד in vivo בהשוואה לתרבויות חד -שכבתי דו -ממדיות. מערכות אלה מקדמות אינטראקציות תאים ותאים - ניתן להשתמש בתרבויות תלת מימד ראשוניות של הפטוציטים כדי לחקור כבד פונקציות ספציפיות בסביבה יותר in vivo -, ומציעים יתרונות לבדיקת תרופות, הערכת רעילות ומודלים של מחלות.

   מודל ספירואידי

באמצעות טכניקות כמו תרבות התקשרות נמוכה במיוחד, תרבית ירידה תלויה ותרבית תאים מגנטיים (איור 5), הפטוציטים הראשוניים יכולים לצבור לאגרגטים כדוריים בקוטר של עד 150 - 175 מיקרומטר מבלי להסתמך על מטריצות חיצוניות. יתרון אחד בתרבות הספירואידית הוא שכל ספירואיד דורש רק 1,330 - 2,000 תאים, ומפחית משמעותית את מספר התאים בהשוואה לטכניקות תרבות תלת מימד אחרות. מחקרים אחרונים הראו כי תרבויות ספירואידיות ראשוניות של הפטוציטים יכולות לקיים עד 5 שבועות, כאשר פעילות האנזים של CYP נותרה כמעט ללא שינוי בין יום 8 ליום 35. ניתוח פרוטאומיקה חשף כי בהשוואה לתרבות הכריכים, אנזימים האחראים על ספיגת סמים, תפוצה, מטבוליזם וחלוקה הם טובים יותר עבור 14 יום בתרבות ספירואידים. עם זאת, הכבד מורכב הרבה יותר מאשר מצטבר תאים. הצד הבסולטרלי של הפטוציטים מקיים אינטראקציה עם דם, ואילו מרה זורמת מהצד האפיקי, המהווה תכונה מרכזית במבנה לובול הכבד המורכב, ועדיין לא ניתן לשכפל זאת במודל הספירואידי.

יישומים:

1. 1). מחקר על פינוי מורכב מטבוליזציה איטית ומטבוליטים שלו.
2. 2). מחקר על הפטוטוקסיות.
3. 3). הערכת ספיגת הסלולר, אנדוציטוזיס, בריחה אנדוזומלית והשתקת השפעות על גני היעד של תרופות חומצות גרעין קטנות ממוקדות.

איור 5. שיטת תרבות ספירואידית

מודל אורגני כבד

הגדרת הקונצנזוס של אורגנואידים היא: מבנים תלת -ממדיים הנגזרים מתאי גזע, תאי אבות או תאים מובחנים, המסוגלים לשחזר פונקציות ומבנים מסוימים של הרקמה הילידית במבחנה, תוך חיקוי יעיל של המיקרו -סביבה in vivo ותא - אורגני כבד זוהו כמודל המתקדם ביותר למחקר ביולוגי כבד אנושי.

מקורות תאים לבניית אורגנואידים בכבד:

① תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSCs):

תאי גזע עובריים (ESCS) ותאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים (IPSC) הם בעלי פלוריפוטנציה גבוהה, פלסטיות ויכולת ריבוי בלתי מוגבלת. תחת השפעה של גורמי איתות ספציפיים הם מבדילים את הפטוציט - כמו תאים עם פעילות ותפקוד. עם זאת, אורגנואידים בכבד הנגזרים מ- PSCs עשויים לעבור שינויים אפיגנטיים וגנטיים, המציגים שינויים אנאופלואידיים כרומוזומליים במהלך ההגברה.

יישומים:

1. 1). מודלים של מחלות כבד גנטיות
2. 2). מודלים של מחלות כבד זיהומיות
3. 3). בדיקת ציטוטוקסיות של תרופות

② רקמת כבד - תאים נגזרים: אלה כוללים כולאנגיוציטים והפטוציטים. הפטוציטים בוגרים שומרים על פוטנציאל תאי גזע ויכולת התפשטות בסביבות ספציפיות. בהשוואה ל- PSC - אורגנואידים נגזרים, אורגנואידים הנגזרים מרקמות ראשוניות הם בוגרים יותר, עם גנומים יציבים יותר, ושומרים על יציבות פנוטיפית וגנטית במהלך תרבות חוץ גופית ארוכה. עם זאת, יכולת ההתרבות הארוכה של המונח של אורגנואידים הפטוציטים אנושיים בוגרים מוגבלת בהשוואה להפטוציטים אנושיים עובריים או הפטוציטים ראשוניים של עכבר למבוגרים. טיפוח אורגני הפטוציטים למבוגרים נותר מאתגר.

שיטת תרבות (איור 6): רקמת הכבד מתעכלת לתאים בודדים, ותערובת של מטריגל ותאים זורמת בצלחת 24 - באר ליצירת מבנים בצורת כיפה. דגירה בחממה של תרבית תאים (37 מעלות צלזיוס) למשך 15 דקות. לאחר התמצקות, הוסף מדיום תרבות ספציפי. מעבר לאחר כ -14 יום. החלף את המדיום המקורי במדיום בידול לאחר 7 - 10 ימים.

יישומים:

1. 1). דגמי כבד -רעילות
2. 2). מחקרי הפרעות מטבוליזם חוץ גופיות
3. 3). לא - מחלת כבד שומנית אלכוהולית
4. 4). פיתוח תרופות למחלות כבד שפירות וממאירות

איור 6 איור 6. תרבות ותהליך מעבר של רקמות - אורגני כבד נגזרים

מקור: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

השוואה בין תרבות ספירואידית ותרבות אורגנואידית

4. מודל תרבות ראשוני של הפטוציטים

1. 1. מודל תרבותי ראשוני דו -מימדי CO - מודל תרבות
      

      במודל התרבות ההפטוציטים הראשוני של הפטוציטים הראשוניים, שני סוגי תאים שונים או יותר מעורבבים ומתורבתים בסביבה דו -ממדית. מאפיין המפתח במודל זה הוא האינטראקציה הישירה בין סוגי תאים שונים, האינטראקציה בין תאים למטריצה ​​החוץ תאית, או העברת האות העקיפה באמצעות ציטוקינים ותקשורת כימית. ניתן לשמור על פונקציות הפטוציטים ראשוניות, כגון ייצור אלבומין ויכולת חילוף החומרים התרופתי, למשך עד שלושה שבועות.

      יישומים:

      1. 1). הפטוציטים ראשוניים CO - מעובדים עם פיברובלסטים: מודל זה משמש ללימוד קצב המרווח של תרכובות מטבוליזציה איטיות ומטבוליטים שלהם.
      2. 2). הפטוציטים ראשוניים CO - מתורבתים בתאי כבד פרנכימליים שאינם - (למשל, תאי כיתוב, תאי אנדותל סינוסואידים): מודל זה שימושי לחקר תרופות - פגיעה בכבד (DILI), מכיוון שהוא מסייע לחקור את תפקידם של ציטוקינים, כימוקינים וגורמי גדילה במודולציה של תגובות כבדות כבדים לאחר חשות התרופות.
      3. 3). הפטוציטים ראשוניים CO - מתורבת בתאי T: מודל זה משמש לאיתור חילוף החומרים של תרופת הכבד - תגובות ספציפיות לתאי T.
      4. 4). ™ Hepatomax של iphaseCO - מערכת תרבות: iPhase פיתחה מערכת תרבות CO - עם הפטוציטים ראשוניים ממינים שונים, המכונה Hepatomax™ו על ידי CO - טיפוח הפטוציטים ראשוניים אנושיים עם תאי סטרומה, ניתן לשמור על תרופה טובה - מטבוליזציה של פעילות האנזים בהפטוציטים אנושיים למשך עד 3 שבועות. מערכת זו מתאימה לחקר איטי - חילוף חומרים של שיעורי פינוי מורכבים ומטבוליטים שלהם.

      מודל תרבות CO - זה מספק פלטפורמה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית להערכת חילוף חומרים, רעילות ותהליכי מחלות קשורים בכבד, ומציעה תובנות כיצד סוגי תאים שונים תורמים לתפקוד הכבד ולמחלות.
      
      

      מודל תרבותי ראשוני תלת -ממדי

      ישיר תלת מימד CO - תרבות: מודל זה כולל ערבוב של שני סוגים שונים או יותר של תאי כבד (למשל, הפטוציטים ראשוניים, תאי אנדותל סינוסואידיים, תאי כבוד של כבד, תאי קופפר) ליצירת כדורי כדורים עצמיים המורכבים או משותף אותם בסביבה תלת -ממדית שנבנתה עם חומרים כמו קולגן, פיברן, אלגזין או הידרוגלים. תרבות ישירה 3D CO - מאפשרת אינטראקציה קרובה בין תאי כבד שונים באמצעות מנגנונים כמו תא - עד - הידבקות תאים, איתות paracrine באמצעות ציטוקינים מסיסים והידבקות מטריצה ​​חוץ תאית, המאפשרת תקשורת בין הפטוציטים.

      יישומים:

      1. 1). מודל פיברוזיס בכבד: משמש לחקר המנגנונים והתקדמות פיברוזיס הכבד.
      2. 2). תרופה - מודל פגיעה בכבד (DILI): מסייע בהדמיה והערכת נזקי כבד הנגרמים כתוצאה מתרופות.
      3. 3). אינטראקציות תרופות, חילוף חומרים תרופתי וגירוי אנזים: מעריך כיצד תרופות שונות מתקשרות, כיצד הן מטבוליזציה וכיצד הן גורמות לאנזימי כבד.

      תרבות עקיפה 3D CO - תרבות: שיטה זו משתמשת במערכת הפרדה פיזית (למשל, טרנסוול או חומרים אחרים) כדי לתרבות שני סוגים או יותר של תאים (כגון הפטוציטים ראשוניים עם תאי NIH/3T3 או תאי אנדותל סינוסואידי) בסביבה תלת -ממדית, שם נמנע תא ישיר - למגע תאים. התקשורת בין התאים מתרחשת באמצעות ציטוקינים מסיסים.

      יישומים:
      משמש ללימוד תקשורת שאינה מגע בין תאי כבד בגוף.

      
      לסיכום, IPhase, כמובילה במחקר ביולוגי חוץ -גופני, מספק פתרונות מקיפים לבדיקות תרופות קליניות שאינן - החל מהבידוד והתרבות של הפטוציטים הראשוניים ממינים שונים ועד פיתוח מוצרים תומכים כמו מדיה תרבותית ליישומים ספציפיים או לוחות קולגן מרובי - מפרט - צלחות מצופות, IPhase מוקדש להציע את כלי המחקר המבחנה ביותר לגילוי תרופות ופיתוח. אנו שותף מהימן עבור לקוחות בתעשיית התרופות, המחויבים לספק פתרונות חיתוך למחקר לא קליני.