誘導ラット肝臓S9画分：in vitro遺伝毒性および突然変異試験のための代謝活性化システム

キーワード： OECD 471、OECD 473、OECD 476、OECD 487、突然変異テスト、遺伝毒性、遺伝毒性、誘導ラット肝臓S9、AMESテスト、ミニエイムステスト、染色体異常、ミクロナクルス、HPRT/HGPRTアッセイ、TKアッセイ

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導入

誘導ラット肝臓S9の評価における重要なコンポーネントです遺伝的毒性特に規制毒物学における化学物質の可能性。それは、次のようなin vitroアッセイと組み合わせて一般的に使用されます。AMESテスト そして突然変異テスト、化合物の変異原性特性を評価する。シトクロムP450（CYP450）が豊富な酵素システムを提供することにより、誘導されたラット肝臓S9画分は、肝臓で発生する代謝プロセスをシミュレートする上で重要な役割を果たし、化学物質が潜在的に遺伝的変異または癌を引き起こす可能性があるかどうかを判断するのに役立ちます。

誘導ラット肝臓S9

肝臓S9画分は、一連の遠心分離ステップの後にラット肝臓ホモジネートから得られたポスト-ミトコンドリア上清を指します。 「誘導」という用語は、肝臓酵素、特にシトクロムP450酵素（CYP450）の活性を促進する特定の化合物によるラットの処理を指します。

誘導されたラット肝臓S9画分には、化学物質の第I相および第II相代謝に関与するさまざまな酵素が含まれています。これには、基質の酸化的生体内変化を促進するシトクロムP450モノオキシゲナーゼなどの酵素が含まれます。

CYP450活性と代謝活性化

シトクロムP450酵素ファミリー（CYP450）は、多くの医薬品、環境化学物質、発がん物質など、多種多様な物質の代謝に極めて重要な役割を果たします。誘導されたラット肝臓S9画分にはこれらの酵素が含まれており、代謝活性化後にのみ遺伝毒性になる可能性のある化学物質を評価するために不可欠です。

多くの化合物は当初は非毒性ですが、肝臓の代謝後に毒性になる可能性があります。これらのプロ-変異原（代謝活性化が変異原性になるために必要な）およびプロ-発がん物質（がんを引き起こすために活性化が必要）は、S9代謝活性化システムを含むアッセイによってのみ検出できます。 CYP450のような代謝酵素の誘導がなければ、これらの物質は標準的な遺伝毒性テストでは無害であると思われる可能性があります。

誘導されたラット肝臓S9をin vitroアッセイに添加することにより、研究者は物質がCYP450酵素とどのように相互作用するかを評価できます。 CYP450酵素による代謝は多くの薬物の薬物動態の重要なステップであるため、これは医薬品にとって特に重要です。

誘導ラット肝臓S9の応用

1. 1。エイムズテスト（OECD 471）

ガイドラインで概説されているAMESテストOECD 471、変異原性を評価するための最もよく知られており、広く使用されている方法の1つです。それは、サルモネラ細菌の株を試験化学物質にさらして、細菌がヒスチジン-独立した状態に戻る突然変異を誘導するかどうかを確認することを伴います。

ヒトの代謝プロセスをシミュレートするために、誘導されたラット肝臓S9がテストシステムに追加されることがよくあります。 S9画分は、CYP450を含む必要な酵素を提供します。CYP450は、化合物を細菌DNAの変異を引き起こす可能性のあるより反応性のある型に代謝する必要がある場合があります。 S9とAMESテストのこの組み合わせにより、直接的な活性化された変異原性メカニズムの両方を模倣することにより、変異原性のより包括的な評価が可能になります。

2. 2.突然変異試験（染色体異常検査、小核検査、およびその他のin vitroアッセイ）

AMESテストに加えて、変異試験は一般に化学物質の遺伝毒性の可能性を評価するために使用されます。これらの検査は、染色体変異、遺伝子変異、微小核の形成など、さまざまな遺伝的損傷の評価においてより包括的です。誘導ラット肝臓S9は、次の理由で突然変異試験で利用されます。

小核検定（OECD 487）

このテストは、細胞内の核または全体の染色体を含む小核外体である細胞内の微小核の形成を検出します。 小核検定クラストジェニック（染色体-破壊）および動脈瘤（染色体数に影響する）効果を検出できます。誘導ラット肝臓S9は、肝臓酵素によって代謝された場合にのみ染色体損傷を引き起こすため、いくつかの化学物質が染色体損傷を引き起こすため、代謝的に試験物質を活性化するためにここで使用されます。 S9画分は、in vivoで発生する可能性のある代謝活性化をシミュレートすることにより、テストの感度を高めます。

染色体異常検査（OECD 473）

このテストでは、物質が休憩、削除、転座、またはその他の種類の異常を誘導することにより、染色体に構造的損傷を引き起こす可能性があるかどうかを評価します。小核検定のように、染色体異常検査代謝活性化の有無にかかわらず適用できます。誘導ラット肝臓S9を試験システムに追加して、肝臓の代謝プロセスを模倣し、元の形で染色体損傷を引き起こさない可能性のある物質の評価を可能にしますが、肝臓の代謝後にそうすることができます。

表1。突然変異試験の比較考慮事項

HPRT/HGPRTアッセイ（OECD 476）

でHPRT/HGPRTアッセイ、中国のハムスター（CHOまたはV79）またはヒトリンパ芽球（TK6）細胞の培養物は、誘導されたラット肝臓S9代謝混合物の存在下で試験化学物質にさらされます。これは、プロ–ミューテなくなるCYP450酵素をDNA-特性種に変換するために必要な酵素を供給します。短い治療と7日間の発現期間の後、細胞は6-チオグアニンで挑戦されます。ヒポキサンチン - ガニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子の機能喪失変異を持つクローンのみが生存します。変異体のコロニー数を全体的な生存率と比較することにより、研究者は、同時対照と履歴コントロールの両方で再現性がある場合、遺伝毒性の潜在能を示す変異頻度を決定します。

TKアッセイ（OECD 490＆ OECD 476）

TheTKアッセイ L5178Yマウスリンパ腫細胞（OECD 490）またはCHO細胞（OECD 476）チミジンキナーゼ遺伝子座でヘテロ接合を操作した。化学物質曝露±S9混合後、細胞は回復し、トリフルオロチミジンを含む培地に播種され、TK充填細胞を殺します。生き残ったTk⁻変異体は10〜14日間にわたってコロニーを形成し、染色体イベントと点変異を反映する大植葉変異体を反映した小コロニー変異体をしばしば反映しています。 HPRT/HGPRTアッセイと同様に、厳しい細胞毒性コントロールと陽性変異体ベンチマークは、観察された変異頻度の増加が化合物の遺伝毒性リスクを確実に反映することを保証します。

4. 4。がんリスク評価

誘導ラット肝臓S9は、癌の評価を目的とした研究でも使用されています-物質の可能性を引き起こす。ヒト肝臓で発生する代謝プロセスをシミュレートすることにより、S9画分は、DNAに結合できる反応性代謝物の形成につながり、がんにつながる可能性のある変異を引き起こす可能性のある化合物を特定するのに役立ちます。

誘導されたハムスター肝臓S9を使用したエイムステストの強化

欧州医薬品局（EMA）が発行した最新のガイドラインによると、従来のAMESテストは、特定のN -ニトロソアミン不純物、特にN -ニトロソジメチルアミン（NDMA）の変異原性の可能性を検出するのに十分な敏感ではない可能性があります。したがって、米国食品医薬品局（FDA）の部門である国立毒性研究センター（NCTR）によって開発された拡張されたAMESテストは、より信頼できる代替手段として推奨されています。強化されたAMESテストでは、30％のラット肝臓S9と30％のハムスター肝臓S9を含む誘導ハムスター肝臓S9を追加しました。ラットとハムスターデスモソーム上清（S9S）は、シトクロムP450酵素-誘導物質で処理したげっ歯類肝臓から調製する必要があります。誘導されたハムスター肝臓S9を使用することにより、この強化されたテストは人間の代謝をよりよくシミュレートし、結果の信頼性を高めます。

結論

誘導ラット肝臓S9は、遺伝毒性試験の重要なツールとして機能し、研究者と規制当局が化学物質の変異原性および発がん性の可能性を評価するのに役立ちます。代謝活性化システムを提供することにより、代謝活性化が遺伝毒性になるために代謝活性化を必要とする物質を検出するために、AMESテスト、突然変異テスト、CYP450活性研究などのアッセイの能力を高めます。その用途は、新薬、化学物質、消費者製品の安全性を確保するために不可欠です。ヒト肝臓の代謝をシミュレートする役割により、誘導されたラット肝臓S9画分は、現代の毒物学と規制の安全性評価の不可欠な部分であり続けています。