原発性肝細胞：非臨床in vitro薬物研究を進めるための重要なツール

原発性肝細胞：非臨床in vitro薬物研究を進めるための重要なツール

肝臓は、薬物曝露の主要な臓器として、薬物代謝と毒性プロセスにおいて重要な役割を果たします。原発性肝細胞には、細胞特性と生理学的レベルの全スペクトルがあり、酵素および補因子の生理学的レベルは、シトクロムP450（滑らかな小胞体の混合-機能オキシダーゼ）および細胞質エステラーゼなどの膜-結合酵素を含み、すべてのメタボリックパスウェイに包まれています。このため、原発性肝細胞は、in vitro肝臓モデルを構築するためのゴールドスタンダードと広く見なされており、薬物相互作用、薬物代謝、毒性研究の研究者によって好まれています。この記事では、一次肝細胞と医薬品開発におけるその応用に基づいた2Dおよび3D培養モデルの概要を説明します。

キーワード：一次肝細胞、2D栽培、3D栽培、オルガノイド、CO -培養。

1. 1。一次肝細胞の分離

一次肝細胞の分離は、in vitro肝臓モデルを確立するための重要なステップであり、2つの-ステップコラゲナーゼ灌流法が最も一般的に使用されています。小さな動物では、肝臓の静脈または下大静脈を介して肝臓の灌流を行うことができますが、大きな動物は通常、肝臓の葉またはセグメントを介して灌流を必要とします。いくつかの重要な要因は、肝細胞の分離の成功に影響を与えます。まず、コラゲナーゼは細胞毒性がないはずです。第二に、消化のタイミングは非常に重要です - -消化と過剰-消化の両方が肝細胞の収量と生存率を損なう可能性があります。第三に、肝細胞は虚血性損傷に非常に敏感であるため、肝臓の状態は最適でなければなりません。肝細胞の調製に使用される肝臓は、代謝率を低下させ、代謝低酸素症とその後の虚血を防ぐために迅速に冷却する必要があります。

薬物研究で使用される一次肝細胞の基準は次のとおりです。

1. 2。一次肝細胞2D培養

サスペンション肝細胞モデル

完全な薬物-代謝酵素と補因子が含まれており、さまざまな代謝クリアランス経路の研究に適しています。ただし、懸濁液肝細胞の生存率と薬物-代謝酵素の活性は、in vitroインキュベーション時間が増加すると徐々に減少し、インキュベーション時間を最大4時間に制限します。このモデルは、通常、中程度から高いクリアランス率の薬物のクリアランスを推定するために使用されます。クリアランス率が20％未満の場合、正確なクリアランス値を決定できません。従来の懸濁液肝細胞- in vitroの代謝モデルに基づいているのは、ゆっくりとした代謝化化合物の検出可能な代謝反応を生成するには不十分であるため、これらの化合物のクリアランス速度と代謝産物を予測する能力が制限されます。サスペンション肝細胞リレー法（図1）を使用して、インキュベーション時間を20時間またはさらに長く延長することができます。

応用：小分子薬物の酵素活性と代謝安定性研究。

図1。サスペンション肝細胞リレーメソッド転送プロセス

出典：Drug Metab Diss、2012,40（9）：1860–1865

柔軟な肝細胞モデル

原発性肝細胞は、コラーゲン-コーティングされた培養プレート上の2Dシステムで培養されます。肝細胞は上皮の形態を示し、核が突き出ており、しばしば二核形態で提示されます。単一の肝細胞単層培養の欠点には、次のものが含まれます。1。細胞極性と機能の変化2。通常の機能に必要な他の関連する細胞タイプ（つまり、非実質細胞）の欠如。機能を実行する際に肝細胞をサポートするために十分な栄養素とパラクリン因子を提供できない（胆汁酸や血清タンパク質生合成など）。

アプリケーション：

1）。薬物の評価-薬物相互作用：これには、酵素誘導、酵素阻害、および輸送体の研究が含まれます。第一に、薬物が誘導因子として作用すると、薬物の発現の増加につながる可能性があります-代謝酵素とトランスポーター。強力な誘導者は、CYP2B6、CYP3A4、CYP2C9、UGT、およびMRP2などのいくつかの輸送タンパク質のフェノバルビタール誘導など、複数の遺伝子を同時に上方制御できます。第二に、肝細胞が誘導因子にどのように反応するかには種-特定の違いがあります。たとえば、リファンピシンは、ヒトおよびウサギ肝細胞の効果的な誘導剤ですが、ラット肝細胞に誘導効果はありません。最後に、柔軟な肝細胞の最適ではないメッキ密度は、p450の基底発現の減少と人為的に誘導応答の増加につながる可能性があります。図3に示すように、めっき密度の低い肝細胞は、CYP1A2、CYP2B6、およびCYP3A4の基底活性が低いことを示していますが、誘導応答が強くなっています。したがって、生理学的に関連するデータを取得するには、適切なメッキ密度の健康な肝細胞が必要です。

図2。凍結保存されたヒト肝細胞と酵素誘導のメッキ密度との関係

出典：Current Drug Discovery Technologies、2010、7：188 - 198

2）。肝毒性評価：細胞の形態、液胞および脂質液滴の凝集、細胞の付着/剥離など、光学顕微鏡下での形態学的変化を観察します。肝細胞壊死（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼによって示される）およびアポトーシス（DNA断片化）の検出。サイトカイン-媒介細胞毒性の場合、肝細胞の単一単層培養培養物は、隣接する非実質細胞、星細胞、副斜面内皮細胞などの物質から放出される物質による調節により、毒性反応を予測することはできません。

3）。ゆっくりとした代謝化化合物クリアランスとその代謝産物の研究のための「リレー法」：薬物の活性-柔軟な肝細胞における代謝酵素は、24時間のめっき後に減少し始めます。優れた肝細胞を血清- 24時間の化合物を含む遊離培地とインキュベートした後、培地を収集して混合し、さらなる研究のために新しい繁殖可能な肝細胞に移します（図3）。

図3

出典：薬物代謝文字、2016、10：3 - 15

3）。肝細胞の標的遺伝子に対する細胞の摂取、エンドサイトーシス、エンドソーム脱出、サイレンシング効果を評価します-標的小核酸薬物。

サンドイッチ栽培モデル

in vitroでは、肝細胞を2層のコラーゲンまたはマトリゲルの間で培養して、サンドイッチ栽培として知られるin vivo構造を再構築できます。 2層のゲル-コラーゲン（サンドイッチ構造）の間で培養された肝細胞は、細胞の形態と生存率を改善し、その機能をより長い期間維持することができます。さらに、サンドイッチ培養における肝細胞は極性を回復し、基底外側および小型輸送体の適切な局在化、ならびに機能的胆管ネットワークの形成を可能にします（図4）。

図4。ヒト肝細胞サンドイッチモデルにおけるトランスポーターの偏光発現

出典：Current Drug Discovery Technologies、2010、7、188 - 198

アプリケーション：

1. 1）。化合物の胆道排泄の推定。
2. 2）。内因性および外因性化合物および代謝産物の肝臓および胆道分布の評価。
3. 3）。代謝とトランスポーターによって媒介されるクリアランスの推定、および生理学の構築-ベースの薬物動態モデル。
4. 4）。肝毒性の研究と臨床薬物のメカニズムの提供-誘導肝障害。データはシステムの薬理モデルに統合されて、潜在的な薬物-誘発性肝障害を予測します。
5.  
   1. 3。一次肝細胞3D培養

6. 3D培養システムでは、肝細胞は3つの寸法マトリックスで培養され、2D単層培養と比較してin vivo肝臓の建築をよりよく模倣します。これらのシステムは、細胞-細胞と細胞-マトリックスの相互作用を促進し、薬物代謝、タンパク質分泌、胆汁形成など、肝臓の生理学的機能をより多く回復させることができます。原発性肝細胞3D培養は、肝臓での特定の機能を研究するために使用できます。

   スフェロイドモデル

ウルトラ-低い付着培養、吊り下げ滴培養、磁気細胞培養などの技術（図5）を通じて、一次肝細胞は、外部マトリックスに依存せずに直径150 - 175 µmの球状凝集体に凝集できます。スフェロイド培養の利点の1つは、各スフェロイドが1,330 - 2,000細胞のみを必要とし、他の3D培養技術と比較して細胞の数を大幅に減らすことです。最近の研究では、原発性肝細胞のスフェロイド培養が最大5週間維持できることが示されており、CYP酵素活性は8日目から35日目の間にほとんど変化しません。プロテオミクス分析により、サンドイッチ培養と比較して、薬物吸収、分布、代謝、および排出の原因となる酵素は、球形培養で14日間に保存されています。ただし、肝臓は細胞の凝集よりもはるかに複雑です。肝細胞の基底外側側は血液と相互作用しますが、胆汁は頂端側から流れ出ています。これは、複雑な肝臓の小葉構造の重要な特徴であり、これはまだスフェロイドモデルでは再現できません。

アプリケーション：

1. 1）。ゆっくりとした代謝化複合クリアランスとその代謝産物の研究。
2. 2）。肝毒性研究。
3. 3）。肝細胞の標的遺伝子に対する細胞摂取、エンドサイトーシス、エンドソームエスケープ、およびサイレンシング効果の評価-標的小核酸薬。

図5。スフェロイド培養法

肝臓オルガノイドモデル

オルガノイドのコンセンサス定義は、幹細胞、前駆細胞、または分化した細胞に由来する3D構造であり、in vitroで天然組織の特定の機能と構造を再現することができ、in vivo微小環境と細胞と細胞の相互作用を効果的に模倣します。肝臓のオルガノイドは、ヒト肝生物学研究の最先端モデルとして特定されています。

肝臓オルガノイド構造の細胞源：

①多能性幹細胞（PSC）：

胚性幹細胞（ESC）および誘導性多能性幹細胞（IPSC）は、高い多能性、可塑性、無制限の増殖能力を備えています。特定のシグナル伝達因子の影響下で、それらは活性と機能を持つ細胞のような肝細胞に区別します。しかし、PSCに由来する肝臓オルガノイドは、増殖中に染色体異数性の変化を示すエピジェネティックおよび遺伝的変化を受ける可能性があります。

アプリケーション：

1. 1）。遺伝的肝疾患モデル
2. 2）。感染性肝疾患モデル
3. 3）。薬物細胞毒性検査

②肝臓組織-由来細胞：これらには胆管細胞と肝細胞が含まれます。成熟肝細胞は、特定の環境で幹細胞の潜在性と増殖能力を保持します。 PSC -由来のオルガノイドと比較して、一次組織に由来するオルガノイドはより成熟しており、より安定したゲノムを備えており、in vitro培養中に表現型および遺伝的安定性を維持します。ただし、成熟したヒト肝細胞オルガノイドの長期増殖能力は、胎児のヒト肝細胞または成体マウス原発性肝細胞と比較して制限されています。成体の肝細胞オルガノイドの培養は依然として困難です。

培養方法（図6）：肝臓組織は単一の細胞に消化され、マトリゲルと細胞の混合物が24 -ウェルプレートに播種され、ドーム-形の構造を形成します。細胞培養インキュベーター（37°C）で15分間インキュベートします。固化後、特定の培地を追加します。約14日後の通過。 7 - 10日後に元の培地を分化培地に置き換えます。

アプリケーション：

1. 1）。肝毒性モデル
2. 2）。 in vitro代謝障害研究
3. 3）。非アルコール脂肪肝疾患
4. 4）。良性および悪性肝疾患の薬物開発

図6。組織の培養と通過プロセス-由来肝臓オルガノイド

出典：Cell＆Bioscience（2023）13：197

球体培養とオルガノイド培養の比較

4。一次肝細胞CO -培養モデル

1. 1. 2D一次肝細胞CO -培養モデル
      

      2D一次肝細胞CO -培養モデルでは、2つ以上の異なる細胞タイプが混合され、2つの次元環境で培養されます。このモデルの重要な特徴は、異なる細胞タイプ間の直接的な相互作用、細胞と細胞外マトリックス間の相互作用、またはサイトカインと化学通信を介した間接的な信号伝達です。アルブミン生産や薬物代謝能力などの一次肝細胞機能は、最大3週間維持できます。

      アプリケーション：

      1. 1）。原発性肝細胞CO -線維芽細胞で培養：このモデルは、低速化化合物とその代謝産物のクリアランス速度を研究するために使用されます。
      2. 2）。初代肝細胞CO -非実質肝細胞（例えば、星細胞、副鼻腔内皮細胞）で培養された：このモデルは、薬物-誘導肝障害（DILI）の研究に役立ちます。
      3. 3）。原発性肝細胞CO - T細胞で培養：このモデルは、肝臓薬の代謝を検出するために使用されます-特定のT細胞応答。
      4. 4）。 iphase's hepatomax™CO - CULTURE SYSTEM：IPHASEは、Hepatomaxとして知られるさまざまな種の原発性肝細胞を持つCO -培養システムを開発しました™。間質細胞を使用してヒト原発性肝細胞を培養することにより、適切な薬物-ヒト肝細胞の代謝酵素活性を最大3週間維持することが可能です。このシステムは、ゆっくりとした化合物クリアランス率とその代謝物の研究に適しています。

      このCO -培養モデルは、薬物代謝、毒性、および肝臓-関連する疾患プロセスを評価するためのより生理学的に関連するプラットフォームを提供し、異なる細胞タイプが肝機能と疾患にどのように寄与するかについての洞察を提供します。
      
      

      3D一次肝細胞CO -培養モデル

      直接3D CO -文化：このモデルでは、2つ以上の異なるタイプの肝細胞（例えば、一次肝細胞、正弦波内皮細胞、肝星細胞、Kupffer細胞）を混合して、コラーゲン、フィブリン、フィブリン、塩酸塩、油酸などの材料で構築された3D環境で自己-組み立てられたスフェロイドまたはCOを形成することを伴います。直接3D CO -培養により、細胞の接着、可溶性サイトカインを介したパラクリンシグナル伝達、細胞外マトリックス接着などのメカニズムを介して、異なる肝細胞間の密接な相互作用が可能になり、肝細胞間の通信が可能になります。

      アプリケーション：

      1. 1）。肝線維症モデル：肝線維症のメカニズムと進行を研究するために使用されます。
      2. 2）。薬物-誘導肝障害（DILI）モデル：薬物によって引き起こされる肝臓の損傷をシミュレートして評価するのに役立ちます。
      3. 3）。薬物相互作用、薬物代謝、および酵素誘導：異なる薬物がどのように相互作用するか、どのように代謝されるか、肝臓酵素をどのように誘導するかを評価します。

      間接的な3D CO -文化：この方法では、3D環境での物理的分離システム（トランスウェルやその他の材料など）を使用して、2種類以上の細胞（NIH/3T3細胞または正弦波内皮細胞を含む一次肝細胞など）を培養します。細胞間の通信は、可溶性サイトカインを介して発生します。

      アプリケーション：
      体内の肝臓細胞間の接触通信の研究に使用されます。

      
      要約すると、Iphaseは、in vitro生物学的研究のリーダーとして、非臨床薬物検査のための包括的なソリューションを提供します。さまざまな種からの一次肝細胞の分離と培養から、特定の用途やマルチ仕様コラーゲン-コーティングプレートのための培地などのサポート製品の開発まで、IPhaseは、生物の発見と開発に最適なin vitro研究ツールを提供することに専念しています。私たちは、製薬業界のクライアントにとって信頼できるパートナーであり、非臨床研究のための削減-エッジソリューションを提供することを約束しています。