1 차 간세포 : 비 - 임상 시험 관내 약물 연구를 진행하는 중요한 도구

1 차 간세포 : 비 - 임상 시험 관내 약물 연구를 진행하는 중요한 도구

약물 노출의 1 차 기관인 간은 약물 대사 및 독성 과정에서 중요한 역할을합니다. 1 차 간세포는 세포 특성 및 생리 학적 수준의 효소 및 보조 인자의 전체 스펙트럼을 보유하며, 세포소 크롬 P450과 같은 막 - 결합 된 효소 (혼합 - 혼합 - 기능 산화 효소) 및 세포질 에스테르 라제, 간에서 발견 된 모든 대사 경로를 포함한다. 이러한 이유로, 1 차 간세포는 시험 관내 간 모델을 구성하기위한 금 표준으로 널리 알려져 있으며 약물 상호 작용, 약물 대사 및 독성 연구에서 연구원들이 선호된다. 이 기사는 1 차 간세포 및 약물 개발에 대한 응용에 기초한 2D 및 3D 배양 모델에 대한 개요를 제공합니다.

키워드 : 1 차 간세포, 2D 재배, 3D 재배, 오가 노이드, 공동 문화.

1. 1. 1 차 간세포의 분리

1 차 간세포의 분리는 시험 관내 간 모델을 확립하는 데 중요한 단계이며, 2 개의 - 스텝 콜라게나 제 관류 방법이 가장 일반적으로 사용된다. 작은 동물에서, 간 관류는 문맥 정맥 또는 열등한 정맥 카바를 통해 수행 될 수 있으며, 큰 동물은 일반적으로 간 엽이나 세그먼트를 통한 관류가 필요합니다. 몇 가지 주요 요인은 간세포의 성공적인 분리에 영향을 미칩니다. 첫째, 콜라게나 제는 세포 독성이어야합니다. 둘째, 소화시기는 중요합니다.소화 및 오버 - 소화는 간세포 수율 및 생존력을 손상시킬 수 있습니다. 셋째, 간세포는 허혈성 손상에 매우 민감하기 때문에 간 상태는 최적이어야합니다. 간세포 제조에 사용되는 간은 신진 대사 속도를 감소시키고 대사성 저산소증 및 후속 허혈을 예방하기 위해 빠르게 냉각되어야합니다.

약물 연구에 사용 된 1 차 간세포에 대한 표준은 다음과 같습니다.

1. 2. 1 차 간세포 2D 배양

현탁액 간세포 모델

여기에는 완전한 약물 - 대사 효소 및 보조 인자가 포함되어있어 다양한 대사 클리어런스 경로를 연구하는 데 적합합니다. 그러나, 현탁액 간세포의 생존력 및 약물 - 대사 효소의 활성은 시험 관내 인큐베이션 시간이 증가함에 따라 점차 감소하여 인큐베이션 시간을 최대 4 시간으로 제한한다. 이 모델은 일반적으로 중등도에서 높은 클리어런스 속도를 가진 약물의 허가를 추정하는 데 사용됩니다. 클리어런스 속도가 20%미만인 경우 정확한 클리어런스 값을 결정할 수 없습니다. 시험 관내 대사 모델 기반 전통적인 현탁 간세포 -는 느린 대사 화합물에 대한 검출 가능한 대사 반응을 생성하기에 충분하지 않으므로, 이들 화합물의 클리어런스 속도 및 대사 생성물을 예측하는 능력을 제한한다. 현탁액 간세포 릴레이 방법 (도 1)을 사용하여 인큐베이션 시간을 20 시간 이상으로 연장 할 수 있습니다.

애플리케이션:소분자 약물에 대한 효소 활성 및 대사 안정성 연구.

그림 1. 서스펜션 간세포 릴레이 방법 전송 공정

출처 : Drug Metab Dispos, 2012,40 (9) : 1860–1865

Plateble Chepatocytes 모델

1 차 간세포는 콜라겐 - 코팅 배양 플레이트에서 2D 시스템에서 배양된다. 간세포는 상피 형태를 나타내며, 돌출 된 핵과 함께 종종 쌍 혈관 형태로 나타납니다. 단일 간세포 단층 배양의 단점은 다음을 포함한다. 1. 세포 극성 및 기능의 변화 .2. 정상적인 기능에 필요한 다른 관련 세포 유형 (즉, 비 실질 세포)의 부족 3. 기능을 수행 할 때 간세포를지지하기에 충분한 영양소 및 파라 크린 인자를 제공 할 수 없음 (예 : 담즙산 및 혈청 단백질 생합성).

응용 프로그램 :

1). 약물의 평가 - 약물 상호 작용 :여기에는 효소 유도, 효소 억제 및 수송 체 연구가 포함됩니다. 첫째, 약물이 유도제로서 작용할 때, 그것은 약물 - 대사 효소 및 수송 체의 발현을 증가시킬 수있다. 강한 유도 제는 CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT 및 MRP2와 같은 몇몇 수송 단백질의 페노 바르 비탈 유도와 같은 다수의 유전자를 동시에 상향 조절할 수있다. 둘째, 간세포가 유도제에 어떻게 반응하는지에 대한 종 - 특정 차이가있다. 예를 들어, 리팜피신은 인간 및 토끼 간세포에 대한 효과적인 유도제이지만, 쥐 간세포에 대한 유도 효과는 없다. 마지막으로, 플래트 가능한 간세포의 차선형 도금 밀도는 P450의 기저 발현 감소 및 인위적으로 증가 된 유도 반응을 초래할 수있다. 도 3에 도시 된 바와 같이, 더 낮은 도금 밀도에서의 간세포는 CYP1A2, CYP2B6 및 CYP3A4의 낮은 기저 활성을 나타내지 만 더 강한 유도 반응을 나타낸다. 따라서, 생리 학적으로 관련된 데이터를 얻으려면 적절한 도금 밀도에서 건강한 간세포가 필요하다.

그림 2. 동결 보존 인간 간세포의 도금 밀도와 효소 유도 사이의 관계

출처 : 현재 약물 발견 기술, 2010, 7 : 188 - 198

2). 간독성 평가: 세포 형태, 액포 및 지질 액적 응집 및 세포 부착/분리와 같은 광학 현미경 하에서 형태 학적 변화를 관찰한다. 간세포 괴사 (아스 파르 테이트 아미노 트랜스퍼 라제, 젖산 탈수소 효소 및 알라닌 아미노 트랜스퍼 라제) 및 아 pop 토 시스 (DNA 단편화)의 검출. 사이토 카인 - 매개 세포 독성의 경우, 간세포의 단일 단일 층 배양은 쿠퍼 세포, 성상 세포 및 정현파 내피 세포와 같은 이웃 비 - 실질 세포로부터 방출 된 물질에 의한 조절로 인해 독성 반응을 예측할 수 없다.

3). 느린 대사 화합물 클리어런스 및 대사 산물 연구를위한 "릴레이 방법": 약물 - 플래트 가능한 간세포에서의 대사 효소의 활성은 24 시간의 도금 후 감소하기 시작한다. 24 시간 동안 관심있는 화합물을 함유하는 혈청 - 유리 배지와 배치 가능한 간세포를 배양 한 후, 배지를 수집하고 혼합 한 다음, 추가 연구를 위해 새로운 플래트 가능한 간세포로 옮겼다 (도 3).

그림 3. PLATEBLE CHEPATOCYTE 릴레이 방법 전송 공정

출처 : 약물 대사 편지, 2016, 10 : 3 - 15

3). 간세포 - 표적화 된 작은 핵산 약물의 표적 유전자에 대한 세포 흡수, 세포 내 이입, 엔도 좀 탈출 및 침묵 효과를 평가합니다.

샌드위치 재배 모델

시험 관내, 간세포는 샌드위치 재배로 알려진 생체 내 구조를 재구성하기 위해 콜라겐 또는 마트리겔의 2 층 사이에 배양 될 수있다. 2 층의 겔 - 콜라겐 (샌드위치 구조) 사이에서 배양 된 간세포는 세포의 형태와 생존력을 향상시키고 더 긴 기간 동안 그들의 기능을 유지할 수있다. 또한, 샌드위치 배양의 간세포는 극성을 회복시켜 기저 측 및 용기 수송 체의 적절한 국소화와 기능적 담관 네트워크의 형성을 허용 할 수있다 (도 4).

그림 4. 인간 간세포 샌드위치 모델에서 수송 체의 편광 발현

출처 : 현재 약물 발견 기술, 2010, 7, 188 - 198

응용 프로그램 :

1. 1). 화합물의 담즙 배설 추정.
2. 2). 내인성 및 외인성 화합물 및 대사 산물의 간 및 담도 분포를 평가합니다.
3. 3). 신진 대사 및 수송 체에 의해 매개되는 클리어런스 추정 및 생리학 - 기반 약동학 적 모델.
4. 4). 간독성 연구 및 임상 약물에 대한 메커니즘 제공 - 간 손상 유도. 데이터는 시스템 약리학 모델에 통합되어 잠재적 인 약물 - 인간의 간 손상을 예측합니다.
5.  
   1. 3. 1 차 간세포 3D 배양

6. 3D 배양 시스템에서, 간세포는 3 차원 매트릭스로 배양되며, 이는 2D 단층 배양에 비해 생체 내 간 건축을 더 잘 모방한다. 이 시스템은 세포 - 세포 및 세포 - 매트릭스 상호 작용을 촉진하며, 이는 약물 대사, 단백질 분비 및 담즙 형성을 포함한 간의 생리적 기능을 더 많이 회복시킬 수 있습니다. 1 차 간세포 3D 배양 물은 간 연구에 사용될 수 있으며,보다 생체 내에서 특정 기능은 약물 검사, 독성 평가 및 질병 모델링의 장점을 제공합니다.

   스페 로이드 모델

Ultra - 낮은 부착 배양, 교수형 낙하 배양 및 자기 세포 배양과 같은 기술을 통해 (도 5), 1 차 간세포는 외부 매트릭스에 의존하지 않고 최대 150 - 175 µm의 직경을 갖는 구형 응집체로 응집 될 수있다. 구형 배양의 한 가지 장점은 각각의 구형이 1,330 - 2,000 세포만을 필요로하며, 다른 3D 배양 기술에 비해 세포의 수를 상당히 감소 시킨다는 것이다. 최근의 연구는 1 차 간세포 구형 배양 물이 최대 5 주 동안 유지 될 수 있으며, CYP 효소 활성은 8 일과 35 일 사이에 거의 변하지 않은 상태로 남아있다. 프로테오믹스 분석은 샌드위치 배양과 비교하여 약물 흡수, 분포, 대사 및 배설을 담당하는 효소가 14 일 동안 스포츠 배정에 대해 더 잘 보존된다는 것을 밝혀냈다. 그러나 간은 세포 응집체보다 훨씬 더 복잡합니다. 간세포의 기저 측면은 혈액과 상호 작용하는 반면, 담즙은 정단 쪽에서 흘러 나오며, 이는 복잡한 간 소엽 구조의 주요 특징이며, 이는 아직 구형 모델에서 복제 할 수 없습니다.

응용 프로그램 :

1. 1). 느린 대사 화합물 클리어런스 및 대사 산물에 대한 연구.
2. 2). 간독성 연구.
3. 3). 간세포의 표적 유전자에 대한 세포 흡수, 세포 내 이입, 엔도 솜 탈출 및 침묵 효과의 평가.

그림 5. 구상 배양 방법

간 오 오노 노이드 모델

오가 노이드의 합의 정의는 다음과 같습니다. 줄기 세포, 전구체 세포 또는 분화 된 세포로부터 유래 된 3D 구조, 시험 관내에서 본래의 조직의 특정 기능 및 구조를 재현 할 수 있으며, 생체 내 미세 환경 및 세포에서 세포 상호 작용을 효과적으로 모방 할 수있다. 간 오가 노이드는 인간 간 생물학 연구를위한 가장 진보 된 모델로 확인되었습니다.

간 오가 노이드 구조를위한 세포 공급원 :

① 다 능성 줄기 세포 (PSC) :

배아 줄기 세포 (ESC) 및 유도 된 다 능성 줄기 세포 (IPSC)는 높은 다 능성, 가소성 및 무제한 증식 용량을 갖는다. 특정 신호 인자의 영향 하에서, 이들은 활성 및 기능을 갖는 세포와 같은 간세포 - 그러나, PSC로부터 유래 된 간 오가 노이드는 후성 유전 학적 및 유전 적 변화를 겪을 수 있으며, 증폭 동안 염색체 이수성 변화를 나타낸다.

응용 프로그램 :

1. 1). 유전 간 질환 모델
2. 2). 전염성 간 질환 모델
3. 3). 약물 세포 독성 검사

② 간 조직 - 유래 세포 : 여기에는 담낭 및 간세포가 포함됩니다. 성숙한 간세포는 특정 환경에서 줄기 세포 잠재력과 증식 능력을 유지합니다. PSC - 유도 된 오가 노이드와 비교하여, 일차 조직으로부터 유래 된 오가 노이드는 더 안정적인 게놈으로 더 성숙하고, 시험 관내 배양 기간 동안 표현형 및 유전 적 안정성을 유지한다. 그러나, 성숙한 인간 간세포 오가 노이드의 장기 용어 증식 능력은 태아 인간 간세포 또는 성인 마우스 1 차 간세포에 비해 제한된다. 성인 간세포 제조사를 배양하는 것은 여전히 ​​어려운 일입니다.

배양 방법 (도 6) : 간 조직을 단일 세포로 소화시키고, 매트리겔 및 세포의 혼합물을 24 - 웰 플레이트에 시딩하여 돔 - 형성 구조를 형성한다. 세포 배양 인큐베이터 (37 ℃)에서 15 분 동안 배양한다. 응고 후 특정 배양 배지를 추가하십시오. 약 14 일 후에 통과. 원래 매체를 7 - 10 일 후 분화 매체로 교체하십시오.

응용 프로그램 :

1. 1). 간독성 모델
2. 2). 시험 관내 대사 장애 연구
3. 3). 비 알코올성 지방간 질환
4. 4). 양성 및 악성 간 질환에 대한 약물 개발

그림 6. 조직의 배양 및 통과 과정 - 유래 간 오 오노 노이드

출처 : Cell & Bioscience (2023) 13 : 197

구형 배양 및 오가 노이드 배양의 비교

4. 1 차 간세포 공동 - 배양 모델

1. 1. 2D 1 차 간세포 공동 - 배양 모델
      

      2D 1 차 간세포 Co - 배양 모델에서, 2 개 이상의 상이한 세포 유형은 2 차원 환경에서 혼합되고 배양된다. 이 모델의 주요 특징은 상이한 세포 유형, 세포와 세포 외 매트릭스 간의 상호 작용 또는 사이토 카인 및 화학적 통신을 통한 간접 신호 전송 사이의 직접적인 상호 작용이다. 알부민 생산 및 약물 대사 능력과 같은 1 차 간세포 기능은 최대 3 주 동안 유지 될 수 있습니다.

      응용 프로그램 :

      1. 1). 섬유 아세포와 함께 배양 된 1 차 간세포 Co -이 모델은 느린 - 대사 화합물 및 이들의 대사 산물의 클리어런스 속도를 연구하는 데 사용됩니다.
      2. 2). 1 차 간세포 공동 - 비 실질 간 세포 (예를 들어, 성상 세포, 정현파 내피 세포) :이 모델은 약물 노출 후 사이토 카인, 케모카인 및 성장 인자의 역할을 조사하는 데 도움이되므로 약물 - 유도 간 손상 (DILI)을 연구하는 데 유용합니다.
      3. 3). 1 차 간세포 Co - T 세포와 배양 :이 모델은 간 약물 대사 - 특정 T 세포 반응을 탐지하는 데 사용됩니다.
      4. 4). iPhase 's Hepatomax ™Co - Culture System : iPHASE는 Hepatomax로 알려진 다른 종의 1 차 간세포를 갖는 Co - 배양 시스템을 개발했습니다.™. 간질 세포와 인간 1 차 간세포를 배양함으로써, 최대 3 주 동안 인간 간세포에서 우수한 약물 - 대사 효소 활성을 유지할 수있다. 이 시스템은 느린 - 대사 화합물 제거율 및 대사 산물을 연구하는 데 적합합니다.

      이 공동 문화 모델은 약물 대사, 독성 및 간 관련 질병 과정을 평가하기위한보다 생리 학적으로 관련된 플랫폼을 제공하여 다른 세포 유형이 간 기능 및 질병에 어떻게 기여하는지에 대한 통찰력을 제공합니다.
      
      

      3D 1 차 간세포 공동 - 배양 모델

      직접 3D 공동 문화:이 모델은 2 개 이상의 상이한 유형의 간 세포 (예를 들어, 1 차 간세포, 정현파 내피 세포, 간 성상 세포, Kupffer 세포)를 혼합하여 콜라겐, 섬유소, 알기 산성 또는 하이드로 겔과 같은 재료로 구성된 3D 환경에서 자체 - 조립 된 구형 또는 공동 배양하는 것을 형성한다. 직접 3D Co - 배양은 세포 - to - 세포 부착, 가용성 사이토 카인을 통한 파라 크린 신호 전달 및 세포 외 매트릭스 접착과 같은 메커니즘을 통해 상이한 간 세포 간의 밀접한 상호 작용을 허용하여 간세포 간의 의사 소통을 일으킨다.

      응용 프로그램 :

      1. 1). 간 섬유증 모델 : 간 섬유증의 메커니즘과 진행을 연구하는 데 사용됩니다.
      2. 2). 약물 - 유도 간 손상 (DILI) 모델 : 약물로 인한 간 손상을 시뮬레이션하고 평가하는 데 도움이됩니다.
      3. 3). 약물 상호 작용, 약물 대사 및 효소 유도 : 다른 약물이 어떻게 상호 작용하는지, 신진 대사 방법 및 간 효소를 유도하는 방법을 평가합니다.

      간접 3D 공동 문화:이 방법은 3D 환경에서 2 개 이상의 세포 (예 : NIH/3T3 세포 또는 정현파 내피 세포를 가진 1 차 간세포 등)에 물리적 분리 시스템 (예를 들어, 트랜스 웰 또는 기타 물질)을 사용합니다. 세포들 사이의 통신은 가용성 사이토 카인을 통해 발생한다.

      응용 프로그램 :
      신체의 간 세포 사이의 비 - 접촉 통신을 연구하는 데 사용됩니다.

      
      요약하면, 시험 관내 생물학적 연구의 리더로서 iCHASE는 비 임상 약물 시험을위한 포괄적 인 솔루션을 제공한다. 다양한 종에서 1 차 간세포의 분리 및 배양에서 특정 응용 또는 다중 사양 콜라겐을위한 배양 배지와 같은지지 생성물의 개발에 이르기까지, ICHASE는 약물 발견 및 개발을위한 최고의 시험 관내 연구 도구를 제공하기 위해 최선을 다하고 있습니다. 우리는 제약 산업의 고객을위한 신뢰할 수있는 파트너이며, 비 임상 연구를위한 최첨단 솔루션을 제공하기 위해 노력하고 있습니다.