Sukelta žiurkių kepenų S9 frakcija: metabolinės aktyvacijos sistema in vitro genotoksiškumui ir mutacijų tyrimams

Raktiniai žodžiai: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, Mutacijos testas, genotoksiškumas, genetinis toksiškumas, sukeltos žiurkių kepenų S9, Ames testas, Mini Ames testas, chromosominis aberacija, mikrotranletus, HPRT/HGPRT tyrimas, TK asisijos reikalas

„IPhase“ produktas

Įvadas

Sukeltos žiurkių kepenys S9yra pagrindinis komponentas vertinantgenetinis toksiškumasCheminių medžiagų potencialas, ypač reguliuojant toksikologiją. Jis dažniausiai naudojamas kartu su in vitro tyrimais, tokiais kaipAmes testas irMutacijų testai, norint įvertinti junginių mutagenines savybes. Pateikdama fermentinę sistemą, kurioje gausu citochromo P450 (CYP450), sukelta žiurkių kepenų S9 frakcija vaidina lemiamą vaidmenį imituojant kepenyse vykstančius metabolinius procesus, padedant nustatyti, ar cheminės medžiagos gali sukelti genetines mutacijas ar vėžį.

Sukeltos žiurkių kepenys S9

Kepenų S9 frakcija reiškia postą - mitochondrijų supernatantas, gautas iš žiurkių kepenų homogenatų po centrifugavimo etapų. Terminas „sukeltas“ reiškia žiurkių gydymą specifiniais junginiais, kurie sustiprina kepenų fermentų, ypač citochromo P450 fermentų (CYP450), aktyvumą, kurie yra atsakingi už įvairių ksenobiotikų diapazono metabolizmą.

Sukeltoje žiurkių kepenų S9 frakcijoje yra įvairių fermentų, kurie dalyvauja I ir II fazės cheminių medžiagų metabolizme. Tai apima fermentus, tokius kaip citochromo P450 monooksigenazės, kurios palengvina substratų oksidacinę biotransformaciją, taip imituojant žmogaus kepenų metabolizmą.

CYP450 aktyvumas ir metabolinis aktyvinimas

Citochromo P450 fermentų šeima (CYP450) vaidina pagrindinį vaidmenį įvairių medžiagų metabolizme, įskaitant daugybę vaistų, aplinkos chemikalų ir kancerogenų. Sukeltoje žiurkių kepenų S9 frakcijoje yra šie fermentai ir yra būtina norint įvertinti chemines medžiagas, kurios gali tapti tik genotoksiniais po metabolinės aktyvacijos.

Daugelis junginių iš pradžių nėra toksiški, tačiau kepenyse gali tapti toksiški, tačiau gali tapti toksiški. Šie pro - mutagenai (kuriems reikia metabolinio aktyvacijos, kad jie taptų mutageniniai) ir pro - kancerogenai (kuriems reikia aktyvuoti vėžį) galima aptikti tik atliekant tyrimus, apimančius S9 metabolinės aktyvacijos sistemą. Neatlikus metabolinių fermentų, tokių kaip CYP450, šios medžiagos gali atrodyti nekenksmingos atliekant standartinius genotoksiškumo testus.

Pridėję sukeltas žiurkių kepenų S9 į in vitro tyrimus, tyrėjai gali įvertinti, kaip medžiaga sąveikauja su CYP450 fermentais. Tai ypač svarbu farmacijai, nes CYP450 fermentų metabolizmas yra kritinis daugelio vaistų farmakokinetikos žingsnis.

Sukeltų žiurkių kepenų S9 taikymas

1. 1. Ames testas (OECD 471)

Ames testas, išdėstytas gairėseOECD 471, yra vienas iš labiausiai žinomų ir plačiai naudojamų mutageniškumo įvertinimo metodų. Tai apima Salmonella bakterijų padermių ekspoziciją bandymo cheminei medžiagai, kad sužinotų, ar tai sukelia mutacijas, dėl kurių bakterijos grįžta į histidiną - nepriklausomą būseną.

Norint modeliuoti žmogaus metabolinį procesą, į bandymų sistemą dažnai pridedama sukeltų žiurkių kepenų S9. S9 frakcija suteikia reikiamus fermentus, įskaitant CYP450, kurių gali prireikti metabolizuoti junginį į reaktyvesnę formą, kuri gali sukelti bakterijų DNR mutacijas. Šis S9 derinys su AMES testu leidžia išsamiau įvertinti mutageninį potencialą, imituojant tiek tiesioginius, tiek metaboliškai aktyvuotus mutageninius mechanizmus.

2. 2.Mutacijų testai (chromosomų aberacijos testas, mikrotrobos testas ir kiti in vitro tyrimai)

Be Ames testo, mutacijos testai dažniausiai naudojami norint įvertinti cheminių medžiagų genotoksinį potencialą. Šie testai yra išsamesni vertinant genetinių pažeidimų diapazoną, įskaitant chromosomų mutacijas, genų mutacijas ir mikrobranduolių susidarymą. Sukeltos žiurkių kepenų S9 naudojama atliekant mutacijos bandymus dėl šių priežasčių:

Mikrobranduolio testas (OECD 487)

Šis testas nustato mikrobrobangų susidarymą ląstelėse, kurios yra mažos, ekstranukleariniai kūnai, kuriuose yra chromosomų fragmentų ar sveikų chromosomų, kurie nebuvo įterpti į branduolį ląstelių dalijimosi metu. Mikrobranduolio testasgali aptikti klasikinį (chromosomą - lūžimą) ir aneugeninį (paveikiantį chromosomų skaičiaus) poveikį. Sukeltos žiurkių kepenų S9 naudojama metaboliškai suaktyvinti bandymo medžiagą, nes kai kurios cheminės medžiagos sukelia tik chromosomų pažeidimus, kai juos metabolizuoja kepenų fermentai. S9 frakcija padidina bandymo jautrumą imituodamas metabolinį aktyvaciją, kuri gali atsirasti in vivo.

Chromosomų aberacijos testas (OECD 473)

Šis testas įvertina, ar medžiaga gali padaryti struktūrinę chromosomų pažeidimą, sukeldama pertraukas, ištrynimus, translokacijas ar kitas aberacijos rūšis. Kaip ir mikrobranduolio testas,Chromosomų aberacijos testasgali būti naudojamas su metaboliniu aktyvavimu arba be jo. Sukeltos žiurkių kepenų S9 pridedama prie bandymo sistemos, kad būtų galima imituoti metabolinius kepenų procesus, leidžiančius įvertinti medžiagas, kurios gali nepadaryti chromosomų pažeidimų pradine forma, bet tai galėtų padaryti po kepenų metabolizmo.

1 lentelė. Lyginamieji mutacijų testų aspektai

HPRT/HGPRT tyrimas (OECD 476)

ĮHPRT/HGPRT tyrimas, Kinijos žiurkėno (CHO arba V79) ar žmogaus limfoblastoidinių (TK6) ląstelių kultūros yra veikiamos bandomosios cheminės medžiagos, esant sukeltam žiurkių kepenų S9 metaboliniam mišiniui, kuris tiekia CYP450 fermentus, reikalingus norint paversti promutagenus į DNR reaktyviąsias rūšis. Po trumpo gydymo ir septynių dienų išraiškos laikotarpio ląstelės kyla iš 6 -tioguanino; Išgyvena tik hipoksantino -guanino fosforibosiltransferazės geno hipoksantino -guanino mutacijos klonai. Palygindami mutantų kolonijų skaičių su bendtu gyvybingumu, tyrėjai nustato mutacijų dažnį, kuris, pakartojamai padidėjęs tiek tuo pačiu metu, ir istorinėje kontrolėje, rodo genotoksinį potencialą.

TK tyrimai (OECD 490 ir OECD 476)

TheTK tyrimas naudoja arba L5178y pelių limfomos ląsteles (EBPO 490) arba Cho ląsteles (OECD 476) inžinerijos heterozigotinis timidino kinazės lokuse. Po cheminio ekspozicijos ± S9 mišinio ląstelės atsigauna ir yra padengtos terpėje, kurioje yra trifluorotimidino, kuris žudo TK pelningas ląsteles. Išgyvenę TK⁻ mutantai sudaro kolonijas daugiau nei 10–14 dienų, kai mažos kolonijos mutantai dažnai atspindi chromosomų įvykius, o didelės kolonijos mutantai atspindi taškų mutacijas. Kaip ir HPRT/HGPRT tyrime, griežtas citotoksiškumo kontrolė ir teigiami mutageno etalonai užtikrina, kad pastebėtas mutacijų dažnio padidėjimas patikimai atspindi junginio genotoksinę riziką.

4. 4. Vėžio rizikos vertinimas

Sukeltos žiurkių kepenys S9 taip pat naudojami tyrimuose, kuriuose siekiama įvertinti vėžį, sukeliantį medžiagų potencialą. Imituodami metabolinius procesus, vykstančius žmogaus kepenyse, S9 frakcija gali padėti nustatyti junginius, kurie gali sukelti reaktyviųjų metabolitų, galinčių surišti prie DNR, susidarymo ir sukeldamas mutacijas, kurios gali sukelti vėžį.

Patobulintas Ames testas su sukeltais žiurkėno kepenimis S9

Remiantis naujausiomis Europos vaistų agentūros (EMA) paskelbtomis gairėmis, tradicinis Ames testas gali būti nepakankamai jautrus, kad būtų galima nustatyti tam tikrų nitrozamino priemaišų mutageninį potencialą, ypač n - nitrozodimetilaminą (NDMA). Todėl patobulintas AMES testas, kurį sukūrė Nacionalinis toksikologinių tyrimų centras (NCTR), JAV maisto ir vaistų administracijos (FDA) padalinys (FDA), buvo rekomenduojamas kaip patikimesnė alternatyva. Patobulintame Ames teste buvo pridėtas sukeltų žiurkėnų kepenų S9, kuris buvo 30% žiurkių kepenų S9 ir 30% žiurkėnų kepenų S9. Žiurkių ir žiurkėnų desmosominiai supernatantai (S9S) turėtų būti paruošti iš graužikų kepenų, apdorotų citochromu P450 fermentu, sukeliančias medžiagas. Naudojant sukeltą žiurkėno kepenys S9, šis sustiprintas testas geriau imituoja žmogaus metabolizmą ir padidina rezultatų patikimumą.

Išvada

Sukeltos žiurkių kepenų S9 yra kritinė priemonė atliekant genotoksiškumo tyrimus, padedant tyrėjams ir reguliavimo agentūroms įvertinti cheminių medžiagų mutageninį ir kancerogeninį potencialą. Pateikdama metabolinę aktyvacijos sistemą, ji pagerina tokių tyrimų, kaip Ames testų, mutacijų testų ir CYP450 aktyvumo tyrimų, gebėjimą aptikti medžiagas, kurioms reikalingas metabolinis aktyvinimas, kad jie taptų genotoksiniais. Jo pritaikymas yra būtinas norint užtikrinti naujų vaistų, chemikalų ir vartojimo produktų saugumą. Dėl savo vaidmens imituojant žmogaus kepenų metabolizmą, sukelta žiurkių kepenų S9 frakcija ir toliau yra nepakeičiama šiuolaikinių toksikologijos ir reguliavimo saugos vertinimų dalis.