Pirminiai hepatocitai: esminė priemonė, leidžianti pažvelgti į klinikinius vaistų klinikinius in vitro tyrimus

Pirminiai hepatocitai: esminė priemonė, leidžianti pažvelgti į klinikinius vaistų klinikinius in vitro tyrimus

Kepenys, kaip pagrindinis vaistų poveikio organas, vaidina lemiamą vaidmenį narkotikų metabolizme ir toksiškumo procesuose. Pirminiai hepatocitai turi visą fermentų ir kofaktorių ląstelių charakteristikų ir fiziologinių lygių spektrą, įskaitant membraną - surišti fermentai, tokie kaip citochromo P450 (mišri - funkcija oksidazėje, esančioje lygiame endoplazminėje retikulume) ir citozolinės esterazės, apima visas metabolizmo kelius, aptinkamus endoplazminėje retikulume). Dėl šios priežasties pirminiai hepatocitai yra plačiai laikomi auksiniu kepenų modelių konstrukcijos standartu ir jiems teikia pirmenybę narkotikų sąveikos, vaistų metabolizmo ir toksiškumo tyrimų tyrėjai. Šiame straipsnyje pateikiama 2D ir 3D kultūros modelių, pagrįstų pirminiais hepatocitais, apžvalga ir jų taikymas kuriant vaistus.

Raktiniai žodžiai: pirminiai hepatocitai, 2D auginimas, 3D auginimas, organoidai, CO - kultūra.

1. 1. Pirminių hepatocitų izoliacija

Pirminių hepatocitų išskyrimas yra kritinis žingsnis nustatant kepenų modelius in vitro. Dažniausiai naudojamas du - žingsnių kolagenazės perfuzijos metodas. Mažesniems gyvūnams kepenų perfuzija gali būti atliekama per portalo veną arba apatinę vena cava, o didesniems gyvūnams paprastai reikia perfuzijos per kepenų skiltis ar segmentus. Keli pagrindiniai veiksniai daro įtaką sėkmingai izoliuoti hepatocitus: Pirma, kolagenazė turėtų būti ne - citotoksinė. Antra, virškinimo laikas yra labai svarbus -Tiek virškinimas, tiek per didesnis - virškinimas gali pakenkti kepenųcitų derliui ir gyvybingumui. Trečia, kepenų būklė turi būti optimali, nes hepatocitai yra labai jautrūs išemijos pažeidimams. Kepenys, naudojamos kepenų paruošimui, turėtų būti greitai aušinamos, kad būtų sumažintas metabolizmo greitis ir užkirstas kelias metabolinei hipoksijai bei vėlesnei išemijai.

Pirminių hepatocitų, naudojamų narkotikų tyrimuose, standartai yra šie:

1. 2. Pirminė kepenų 2D kultūra

Pakabos kepenųcitų modelis

Jame yra visiško vaisto metabolizuojančių fermentų ir kofaktorių, todėl jis yra tinkamas įvairiems metabolinių klirenso keliams tirti. Tačiau suspensijos hepatocitų gyvybingumas ir vaisto aktyvumas - Metabolizuojančių fermentų aktyvumas pamažu mažėja, nes inkubacijos laikas in vitro ilgėja, ribojant inkubacijos laiką ne daugiau kaip 4 valandas. Šis modelis paprastai naudojamas įvertinti vaistų, turinčių vidutinio sunkumo ar didelio klirenso greitį, klirensą. Kai klirenso greitis yra mažesnis nei 20%, tikslių klirenso verčių negalima nustatyti. Tradiciniai suspensijos hepatocitai - Remiantis in vitro metabolizmo modeliais, nepakanka aptinkamoms metabolinėms reakcijoms lėtas - metabolizuojantiems junginiams generuoti, taip ribojant jų gebėjimą numatyti šių junginių klirenso greitį ir metabolinius produktus. Pakabos kepenų relės metodas (1 paveikslas) gali būti naudojamas prailginant inkubacijos laiką iki 20 valandų ar net ilgiau.

Taikymas:Mažų molekulių vaistų fermentų aktyvumo ir metabolinio stabilumo tyrimai.

1 paveikslas. Pakabos kepenųcitų relės metodo perdavimo procesas

Šaltinis: Narkotikų metabo dispos, 2012,40 (9): 1860–1865

Platmenas kepenųcitų modelis

Pirminiai hepatocitai yra auginami 2D sistemoje ant kolageno dengtų kultūros plokštelių. Hepatocitai pasižymi epitelio morfologija, turinti išsikišusius branduolius, kurie dažnai būna binukleated forma. Vieno hepatocitų monosluoksnio kultūros trūkumai apima: 1. Ląstelių poliškumo ir funkcijos pakeitimas.2. Kitų susijusių ląstelių tipų (t. Y. Non - parenchiminių ląstelių), kurių reikia normaliam funkcijai, trūkumas.3. Nesugebėjimas pateikti pakankamai maistinių medžiagų ir paracrino veiksnių, kad būtų galima palaikyti hepatocitus atliekant jų funkcijas (tokias kaip tulžies rūgšties ir serumo baltymų biosintezė).

Programos:

1). Narkotikų sąveikos įvertinimas: Narkotikų sąveika:Tai apima fermentų indukciją, fermentų slopinimą ir pernešėjų tyrimus. Pirma, kai vaistas veikia kaip induktorius, jis gali padidinti vaisto ekspresiją metabolizuojančių fermentų ir pernešėjų. Stiprūs induktoriai vienu metu gali sureguliuoti kelis genus, tokius kaip fenobarbitalinė CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT ir kelių transportavimo baltymų, tokių kaip MRP2, indukcija. Antra, yra rūšių - specifiniai hepatocitų skirtumai reaguoja į induktorius. Pavyzdžiui, rifampicinas yra efektyvus žmogaus ir triušio hepatocitų induktorius, tačiau neturi indukcinio poveikio žiurkių hepatocitams. Galiausiai, suboptimalus plokščiakalnių hepatocitų dengimo tankis gali sumažinti P450 bazinę ekspresiją ir dirbtinai padidėjusį indukcijos atsaką. Kaip parodyta 3 paveiksle, hepatocitai, esant mažesniems densijos tankiams, rodo mažesnį CYP1A2, CYP2B6 ir CYP3A4 bazinį aktyvumą, tačiau stipresni indukcijos atsakai. Todėl norint gauti fiziologiškai svarbius duomenis, būtina sveiki kepenėlės, esant tinkamam dengimo tankiui.

2 paveikslas. Ryšys tarp kriokonsuotų žmogaus hepatocitų ir fermento indukcijos aptraukimo tankio ir fermento indukcijos

Šaltinis: Dabartinės narkotikų atradimo technologijos, 2010, 7: 188 - 198

2). Hepatotoksiškumo vertinimas: Stebint morfologinius pokyčius naudojant šviesos mikroskopą, tokius kaip ląstelių morfologija, vakuolė ir lipidų lašelių agregacija, ląstelių pritvirtinimas/atsiribojimas. Hepatocitų nekrozės aptikimas (kaip rodo aspartato aminotransferazė, laktato dehidrogenazė ir alanino aminotransferazė) ir apoptozė (DNR suskaidymas). Citokino - sukeltas citotoksiškumas, pavienės hepatocitų monosluoksnių kultūros negali numatyti toksiškų atsakų dėl reguliavimo medžiagų, išsiskiriančių iš kaimyninių ne - parenchiminių ląstelių, tokių kaip Kupfferio ląstelės, žvaigždės ląstelės ir sinusoidinės endotelio ląstelės.

3). „Relės metodas“ Lėtai metabolizuojančio junginio klirenso ir jo metabolitų tyrimui: Vaisto aktyvumas Metabolizuojančių fermentų plokščiuose kepenėlėse pradeda mažėti po 24 valandų. Po to, kai inkubuojami plokščiakalniai hepatocitai su serumu - Nemokama terpė, kurioje 24 valandas yra dominančio junginio, terpė renkama ir sumaišoma, po to perkeliama į naujus plokščius hepatocitus tolesniam tyrimui (3 paveikslas).

3 pav.

Šaltinis: Narkotikų metabolizmo laiškai, 2016, 10: 3 - 15

3). Įvertinkite ląstelių įsisavinimą, endocitozę, endosominį pabėgimą ir nutildymo poveikį hepatocitų tiksliniam genui -

Sumuštinių auginimo modelis

In vitro hepatocitai gali būti kultivuojami tarp dviejų kolageno arba Matrigelio sluoksnių, kad rekonstruotų in vivo struktūras, žinomus kaip sumuštinių auginimas. Hepatocitai, auginami tarp dviejų gelio sluoksnių - kolageno (sumuštinių struktūra), gali pagerinti ląstelių morfologiją ir gyvybingumą ir ilgesnį laiką palaikyti jų funkcionalumą. Be to, sumuštinių kultūros kepenys gali atkurti poliškumą, leidžiantį tinkamai lokalizuoti bazolateralinius ir kanalinius pernešėjus, taip pat formuojant funkcinius tulžies latakų tinklus (4 paveikslas).

4 paveikslas. Poliarizuota pernešėjų išraiška žmogaus hepatocitų sumuštinių modelyje

Šaltinis: Dabartinės narkotikų atradimo technologijos, 2010, 7, 188 - 198

Programos:

1. 1). Įvertinant tulžies junginių išsiskyrimą.
2. 2). Įvertinant endogeninių ir egzogeninių junginių ir metabolitų kepenų ir tulžies pasiskirstymą.
3. 3). Įvertinant klirensą, kurį sukelia metabolizmas ir pernešėjai, ir fiziologijos konstrukcija - pagrįsti farmakokinetiniai modeliai.
4. 4). Klinikinių vaistų mechanizmų tyrimas ir klinikinio vaisto mechanizmų sukeltas kepenų sužalojimas. Duomenys yra integruoti į sistemų farmakologijos modelius, kad būtų galima numatyti galimą vaistą, sukeltą kepenų sužalojimą žmonėms.
5.  
   1. 3. Pirminė hepatocitų 3D kultūra

6. 3D kultūros sistemose hepatocitai auginami trijose - matmenų matricoje, kuri geriau imituoja in vivo kepenų architektūrą, palyginti su 2D monosluoksnių kultūromis. Šios sistemos skatina ląstelių - ląstelių ir ląstelių - matricos sąveiką, kuri gali atkurti daugiau kepenų fiziologinių funkcijų, įskaitant vaistų metabolizmą, baltymų sekreciją ir tulžies susidarymą. Pirminės hepatocitų 3D kultūros gali būti naudojamos tiriant kepenims - Specifines funkcijas labiau in vivo - panašiai kaip aplinka, suteikianti pranašumus atliekant narkotikų tyrimus, toksiškumo vertinimą ir ligos modeliavimą.

   Sferoido modelis

Taikant tokius metodus kaip ultra - žemo prisirišimo kultūra, pakabinama kritimo kultūra ir magnetinių ląstelių kultūra (5 paveikslas), pirminiai hepatocitai gali susiburti į sferoidinius agregatus, kurių skersmuo yra iki 150 - 175 μm, nesikreipdami į išorines matricas. Vienas sferoidinės kultūros pranašumas yra tas, kad kiekvienam sferoidui reikia tik 1 330 - 2 000 ląstelių, žymiai sumažinant ląstelių skaičių, palyginti su kitais 3D kultūros metodais. Naujausi tyrimai parodė, kad pirminės hepatocitų sferoidų kultūros gali išlaikyti iki 5 savaičių, o CYP fermento aktyvumas išliko beveik nepakitęs nuo 8 dienos iki 35 dienos. Proteomikos analizė atskleidė, kad, palyginti su sumuštinių kultūra, fermentais, atsakingais už vaistų absorbciją, pasiskirstymą, metabolizmą ir ekstremiją, geriau išsaugota 14 dienų sferos kultūrai. Tačiau kepenys yra daug sudėtingesnės nei ląstelių agregatas. Bazolateralinė hepatocitų pusė sąveikauja su krauju, o tulžies išeita iš viršūninės pusės, o tai yra pagrindinis sudėtingos kepenų lobulo struktūros bruožas, ir to dar negalima atkartoti sferoido modelyje.

Programos:

1. 1). Lėtai metabolizuojančio junginio klirenso ir jo metabolitų tyrimas.
2. 2). Hepatotoksiškumo tyrimai.
3. 3). Ląstelių įsisavinimo, endocitozės, endosominio pabėgimo ir nutildymo poveikis hepatocitų tiksliniams genams įvertinimas -

5 paveikslas. Sferoidinės kultūros metodas

Kepenų organoidų modelis

Organoidų sutarimo apibrėžimas yra: 3D struktūros, gautos iš kamieninių ląstelių, progenitorinių ląstelių ar diferencijuotų ląstelių, galinčių atkurti tam tikras gimtojo audinio funkcijas ir struktūras in vitro, veiksmingai imituodamas in vivo mikroaplinką ir ląsteles - ląstelių sąveikai. Kepenų organoidai buvo nustatyti kaip pažangiausias žmogaus kepenų biologijos tyrimų modelis.

Ląstelių šaltiniai kepenų organoidų konstrukcijai:

① Pluripotentinės kamieninės ląstelės (PSC):

Embrioninės kamieninės ląstelės (ESC) ir sukeltos pluripotentinės kamieninės ląstelės (IPSC) turi didelę pluripotenciją, plastiškumą ir neribotą proliferacinį pajėgumą. Esant veikiantiems specifiniams signalizacijos veiksniams, jie diferencijuojasi į hepatocitą - kaip ląstelės, turinčios aktyvumą ir funkciją. Tačiau kepenų organoidai, gauti iš PSC, gali atlikti epigenetinius ir genetinius pokyčius, todėl amplifikacijos metu chromosomų aneuploidijos pokyčiai.

Programos:

1. 1). Genetinės kepenų ligos modeliai
2. 2). Infekciniai kepenų ligos modeliai
3. 3). Narkotikų citotoksiškumo tyrimas

② Kepenų audinys - Išvestos ląstelės: tai apima cholangiocitus ir hepatocitus. Subrendę kepenėlės, išlaikančios kamieninių ląstelių potencialą ir proliferacinius gebėjimus konkrečioje aplinkoje. Palyginti su PSC - išvedami organoidai, organoidai, gauti iš pirminio audinio, yra labiau subrendę, turintys stabilesnius genomus ir palaiko fenotipinį ir genetinį stabilumą ilgo - termino in vitro kultūroje. Tačiau ilgas subrendusių žmogaus hepatocitų organoidų proliferacinis terminas yra ribotas, palyginti su vaisiaus žmogaus hepatocitais ar suaugusiųjų pelių pirminiais hepatocitais. Suaugusių kepenų hepatocitų organoidų auginimas išlieka sudėtingas.

Kultūros metodas (6 paveikslas): Kepenų audinys yra suskaidytas į atskiras ląsteles, o matrigelio ir ląstelių mišinys yra sėjamas 24 - šulinio plokštelėje, kad susidarytų kupolo - formos struktūros. 15 minučių inkubuokite ląstelių kultūros inkubatoriuje (37 ° C). Po kietėjimo pridėkite specifinę auginimo terpę. Praėjimas po maždaug 14 dienų. Originalią terpę pakeiskite diferenciacijos terpe po 7 - 10 dienų.

Programos:

1. 1). Hepatotoksiškumo modeliai
2. 2). In vitro metabolizmo sutrikimų tyrimai
3. 3). Ne - alkoholinė riebių kepenų liga
4. 4). Narkotikų vystymas gerybinėms ir piktybinėms kepenų ligoms

6 paveikslas. Audinio kultūros ir praėjimo procesas - Išgauti kepenų organoidai

Šaltinis: „Cell & Bioscience“ (2023) 13: 197

Sferoidinės kultūros ir organinės kultūros palyginimas

4. Pirminis hepatocitų CO - kultūros modelis

1. 1. 2d pirminis hepatocitų CO - kultūros modelis
      

      2D pirminiame hepatocitų CO - kultūros modelyje du ar daugiau skirtingų ląstelių tipų yra maišomi ir auginami dviejuose - matmenų aplinkoje. Pagrindinis šio modelio bruožas yra tiesioginė skirtingų tipų ląstelių sąveika, ląstelių ir tarpląstelinės matricos sąveika arba netiesioginis signalo perdavimas per citokinus ir chemines ryšius. Pirminės kepenųcitų funkcijos, tokios kaip albumino gamyba ir vaistų metabolizmo gebėjimas, gali būti palaikomos iki trijų savaičių.

      Programos:

      1. 1). Pirminiai hepatocitai CO - Auginama su fibroblastais: Šis modelis naudojamas lėto - metabolizuojančių junginių ir jų metabolitų klirenso greičiui tirti.
      2. 2). Pirminiai hepatocitai CO - kultivuojami su ne - parenchiminėmis kepenų ląstelėmis (pvz., Stellate ląstelėmis, sinusoidinėmis endotelio ląstelėmis): Šis modelis yra naudingas tiriant vaistą sukeltą kepenų sužalojimą (DILI), nes jis padeda ištirti citokinų vaidmenį, chemokinus ir augimo veiksnius moduliuojant kepenų adaptacinius atsakus po vaisto.
      3. 3). Pirminiai hepatocitai CO - Auginama su T ląstelėmis: Šis modelis naudojamas kepenų vaisto metabolizmui nustatyti specifines T ląstelių atsakas.
      4. 4). „IPhase's Hepatomax ™“CO - Kultūros sistema: „iPhase“ sukūrė CO - kultūros sistemą su pirminiais hepatocituose iš skirtingų rūšių, žinomų kaip hepatomax™. CO - Sugaunant pirminius žmogaus hepatocitus su stromos ląstelėmis, galima išlaikyti gerą vaistą metabolizuojantį fermento aktyvumą žmogaus hepatocituose iki 3 savaičių. Ši sistema yra tinkama lėtai tirti metabolizuojantį junginio klirenso greitį ir jų metabolitus.

      Šis bendras kultūros modelis suteikia fiziologiškai svarbesnę platformą, skirtą įvertinti vaistų metabolizmą, toksiškumą ir kepenis, susijusius su ligos procesais, siūlančiais įžvalgą apie tai, kaip skirtingi ląstelių tipai prisideda prie kepenų funkcijos ir ligų.
      
      

      3D pirminis hepatocitų CO - kultūros modelis

      Tiesioginis 3D Co - kultūra: Šis modelis apima dviejų ar daugiau skirtingų tipų kepenų ląstelių (pvz., Pirminių hepatocitų, sinusoidinių endotelio ląstelių, kepenų žvaigždžių ląsteles, Kupfferio ląsteles) sumaišymą, kad jie surinktų sferoidų arba CO - kultivavimo 3D aplinkoje, tokiose kaip kolagenas, fibrinas, alginatas, arba hidrogels. Tiesioginis 3D CO - kultūra leidžia glaudžiai sąveikauti tarp skirtingų kepenų ląstelių per mechanizmus, tokius kaip ląstelės - iki - ląstelių adhezijos, parakrino signalizacijos per tirpius citokinus ir tarpląstelinės matricos adheziją, įgalinant ryšį tarp kepenųcitų.

      Programos:

      1. 1). Kepenų fibrozės modelis: naudojamas tiriant kepenų fibrozės mechanizmus ir progresavimą.
      2. 2). Vaistas - sukeltas kepenų sužalojimo (DILI) modelis: padeda modeliuoti ir įvertinti kepenų pažeidimus, kuriuos sukelia vaistai.
      3. 3). Narkotikų sąveika, vaistų metabolizmas ir fermentų indukcija: įvertina, kaip skirtingi vaistai sąveikauja, kaip jie metabolizuojami ir kaip jie sukelia kepenų fermentus.

      Netiesioginis 3d Co - kultūra: Šis metodas naudoja fizinio atskyrimo sistemą (pvz., Transwellą ar kitas medžiagas), kad kultūra būtų dviejų ar daugiau tipų ląstelės (pvz., Pirminiai hepatocitai su NIH/3T3 ląstelėmis arba sinusoidinės endotelio ląstelės) 3D aplinkoje, kur neleidžiama tiesiogiai ląstelės - į - ląstelių kontaktą. Ląstelių ryšys vyksta per tirpius citokinus.

      Programos:
      Naudojamas ne - kontaktiniam kepenų ląstelių komunikacijai tyrimui.

      
      Apibendrinant galima pasakyti, kad „iPhase“, kaip in vitro biologinių tyrimų lyderė, pateikia išsamius sprendimus ne - klinikinių vaistų tyrimams. Nuo pirminių hepatocitų izoliacijos ir kultūros nuo įvairių rūšių iki palaikomų produktų, tokių kaip kultūros terpės, kūrimo specifinėms reikmėms arba daugialypės - specifikacijos kolagenui - Padengtos plokštelės, „iPhase“ yra skirta siūlyti geriausias vaistų atradimo ir vystymosi tyrimų priemonių in vitro in vitro. Esame patikimas partneris farmacijos pramonės klientams, įsipareigojusiems pateikti pjaustymo - briaunų sprendimus ne - klinikiniams tyrimams.