Индуциран фракција на црниот дроб на стаорец S9: Метаболички систем за активирање за ин витро генотоксичност и тестови за мутација

Клучни зборови: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, тест за мутација, генотоксичност, генетска токсичност, индуцирана црниот дроб на стаорец S9, AMES Test, Mini Ames Test, хромозомска аберација, микронуклеус, HPRT/HGPRT Анализа, TK Ansionay

Iphase производ

Вовед

Индуциран црн дроб на стаорец S9е клучна компонента во проценката нагенетска токсичностПотенцијал на хемикалии, особено во регулаторната токсикологија. Најчесто се користи во комбинација со ин витро испитувања, како што еТест Амес иТестови за мутација, за да се проценат мутагените својства на соединенијата. Со обезбедување на ензимски систем богат со цитохром P450 (CYP450), индуцираниот фракција на црниот дроб на стаорци S9 игра клучна улога во симулирањето на метаболичките процеси што се јавуваат во црниот дроб, помагајќи да се утврди дали хемикалиите можат потенцијално да предизвикаат генетски мутации или карцином.

Индуциран црн дроб на стаорец S9

Фракцијата на црниот дроб S9 се однесува на пост - митохондријален супернатант добиен од хомогени на црниот дроб на стаорци по серија чекори за центрифугирање. Терминот „индуциран“ се однесува на третман на стаорци со специфични соединенија кои ја подобруваат активноста на ензимите на црниот дроб, особено ензимите на цитохром P450 (CYP450), кои се одговорни за метаболизмот на широк спектар на ксенобиотик.

Индуцираната фракција на црниот дроб на стаорци S9 содржи различни ензими кои се вклучени во метаболизмот на хемикалиите во фаза I и фаза II. Ова вклучува ензими како што се цитохром P450 моноксигенази, кои ја олеснуваат оксидативната биотерансформација на подлоги, со што се имитира метаболизам на црниот дроб на човекот.

Активност на CYP450 и метаболичко активирање

Семејството на цитохром P450 ензим (CYP450) игра клучна улога во метаболизмот на широк спектар на супстанции, вклучително и многу фармацевтски производи, хемикалии во животната средина и канцерогени. Индуцираната фракција на црниот дроб на стаорци S9 ги содржи овие ензими и е од суштинско значење за проценка на хемикалиите кои можат да станат генотоксични само по метаболичко активирање.

Многу соединенија се првично не - токсични, но можат да станат токсични по метаболизмот во црниот дроб. Овие про - мутагени (за кои е потребно метаболичко активирање да стане мутагени) и про - карциногени (за кои е потребно активирање за да предизвикаат карцином) можат да бидат откриени само преку анализи кои вклучуваат систем за активирање на метаболички S9. Без индукција на метаболички ензими како CYP450, овие супстанции може да се чини дека се безопасни во стандардните тестови за генотоксичност.

Со додавање на индуциран црн дроб на стаорец S9 на ин витро испитувања, истражувачите можат да проценат како супстанцијата комуницира со ензимите CYP450. Ова е особено важно за фармацевтски производи, бидејќи метаболизмот од ензимите CYP450 е клучен чекор во фармакокинетиката на многу лекови.

Апликации на индуциран црн дроб на стаорец S9

1. 1. Тест на Амес (ОЕЦД 471)

Тестот Амес, наведен во упатствотоОЕЦД 471, е еден од најпознатите и широко користени методи за проценка на мутагеноста. Вклучува изложување на видови на бактерии на салмонела во тест хемикалија за да се види дали предизвикува мутации што предизвикуваат бактериите да се вратат во независна состојба на хистидин -

За симулирање на човечкиот метаболички процес, индуциран црниот дроб на стаорец S9 често се додава во системот за тестирање. Фракцијата S9 ги обезбедува потребните ензими, вклучително и CYP450, од ​​кои може да се бара да се метаболизира соединението во поактивна форма што може да предизвика мутации во бактериската ДНК. Оваа комбинација на S9 со тестот АМЕС овозможува посеопфатна проценка на мутагениот потенцијал со имитирање на директни и метаболички активирани мутагени механизми.

2. 2.Тестови за мутација (тест за аберација на хромозом, тест за микронуклеус и други ин витро испитувања)

Покрај тестот АМЕС, тестовите за мутација најчесто се користат за проценка на генотоксичниот потенцијал на хемикалиите. Овие тестови се посеопфатни во проценката на низа генетски оштетувања, вклучувајќи хромозомски мутации, генски мутации и формирање на микронуклеи. Индуциран црниот дроб на стаорец S9 се користи во тестови за мутација од следниве причини:

Тест на микронуклеус (OECD 487)

Овој тест открива формирање на микронуклеи во клетките, кои се мали, екстрануклеарни тела кои содржат фрагменти од хромозоми или цели хромозоми кои не се вклучени во јадрото за време на поделбата на клетките. На Тест на микронуклеусможе да открие клистогени (хромозом - кршење) и анегенични (влијаат на бројот на хромозомот). Индуциран црниот дроб на стаорец S9 се користи овде за да се активира тестирачката супстанција метаболички, бидејќи некои хемикалии предизвикуваат само хромозомско оштетување откако ќе се метаболизираат од ензими на црниот дроб. Фракцијата S9 ја подобрува чувствителноста на тестот со симулирање на метаболичкото активирање што може да се случи ин виво.

Тест за аберација на хромозом (ОЕЦД 473)

Овој тест проценува дали супстанцијата може да предизвика структурно оштетување на хромозомите со поттикнување паузи, бришења, преноси или други видови на аберации. Како тестот за микронуклеус,Тест за хромозомска аберацијаможе да се примени со или без метаболичко активирање. Индуциран црниот дроб на стаорец S9 се додава во тест системот за имитирање на метаболичките процеси во црниот дроб, дозволувајќи проценка на супстанции што може да не предизвикаат хромозомско оштетување во нивната првобитна форма, но може да го сторат тоа по метаболизмот на црниот дроб.

Табела 1. Компаративни размислувања за тестовите за мутација

HPRT/HGPRT анализа (OECD 476)

ВоАнализа на HPRT/HGPRT, култури на кинески хрчак (CHO или V79) или човечки лимфобластоидни (TK6) клетки се изложени на тест хемикалија во присуство на индуциран метаболички мешавина на црниот дроб S9, кој снабдува ензими CYP450 потребни за претворање на про -мутагени во ДНК -реактивни видови. По краткиот третман и седумдневниот период на изразување, клетките се предизвикуваат со 6 - тиогуанин; Преживуваат само клонови со загуба - функции во функцијата на хипоксантин - гуански фосфорибозилтрансфераза. Со споредување на броењето на мутантната колонија со целокупната одржливост, истражувачите одредуваат фреквенција на мутација која, доколку репродуктивно се покачи и преку истовремени и историски контроли, укажува на генотоксичен потенцијал.

ТК -анализи (ОЕЦД 490 & ОЕЦД 476)

НаТК анализа вработува или L5178Y клетки на лимфом на глувчето (OECD 490) или CHO клетки (ОЕЦД 476) Инженерски хетерозиготно на локусот на тимидин киназа. После мешање на хемиска изложеност ± S9 мешавина, клетките се опоравуваат и се позлатени во медиуми што содржат трифлуоротимидин, што убива клетки на ТК - со недостаток на клетки. Преживеаните мутанти на TK⁻ формираат колонии во текот на 10-14 дена, при што мутанти на мала колонија честопати ги рефлектираат хромозомските настани и мутанти со голема колонија што рефлектираат мутации на точките. Како и во анализата на HPRT/HGPRT, строгите контроли на цитотоксичност и позитивните одредници на мутаген обезбедуваат дека забележаните зголемувања на фреквенцијата на мутација со сигурност го рефлектираат генотоксичниот ризик на соединението.

4. 4. Проценка на ризик од карцином

Индуциран црниот дроб на стаорец S9 се користи и во студии насочени кон проценка на карциномот - предизвикувајќи потенцијал на супстанции. Со симулирање на метаболичките процеси што се јавуваат кај човечкиот црн дроб, фракцијата S9 може да помогне да се идентификуваат соединенијата што може да доведат до формирање на реактивни метаболити способни за врзување за ДНК и да предизвикаат мутации што можат да доведат до карцином.

Засилен тест на Амес со индуциран црн дроб на хрчак S9

Според најновите упатства издадени од Европската агенција за лекови (ЕМА), традиционалниот тест на АМЕС може да не биде доволно чувствителен за да го открие мутагениот потенцијал на одредени N - нитрозамин нечистотии, особено N - нитрозодиметиламин (НДМА), меѓу другите. Затоа, засилениот тест АМЕС, развиен од Националниот центар за токсиколошко истражување (NCTR), поделба на Управата за храна и лекови на САД (ФДА), се препорачува како посигурна алтернатива. Подобрениот тест АМЕС воведе додавање на индуциран хрчак црн дроб S9, кој настапуваше во содржина на 30% црниот дроб на стаорци S9 и 30% хрчак црн дроб S9. Десмозомските супернатанти на стаорец и хрчак (S9S) треба да бидат подготвени од црниот дроб на глодари третирани со ензим на цитохром P450 - поттикнување на супстанции. Со употреба на индуциран хрчак црн дроб S9, овој засилен тест подобро го симулира човековиот метаболизам и ја зголемува веродостојноста на резултатите.

Заклучок

Индуциран црниот дроб на стаорци S9 служи како критична алатка за тестирање на генотоксичност, помагајќи им на истражувачите и регулаторните агенции да го проценат мутагениот и канцерогениот потенцијал на хемикалиите. Со обезбедување на систем на метаболички активирање, ја подобрува можноста за испитувања како тестот АМЕС, тестовите за мутација и студиите за активност на CYP450 за откривање на супстанции кои бараат метаболичко активирање да станат генотоксични. Неговите апликации се од суштинско значење за обезбедување на безбедност на нови лекови, хемикалии и производи за широка потрошувачка. Со својата улога во симулирањето на метаболизмот на црниот дроб на човекот, индуцираната фракција на црниот дроб на стаорци S9 продолжува да биде неопходен дел од современите проценки на токсикологијата и регулаторната безбедност.