Pecahan S9 Hati Tikus Teraruh: Sistem pengaktifan metabolik untuk ujian genotoksisiti dan mutasi in vitro

Kata kunci: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, Ujian Mutasi, Genotoksisiti, Ketoksikan Genetik, Hati Tikus S9, Ujian Ames, Ujian Mini AMES, Penyimpangan Kromosom, Micronucleus, HPRT/HGPRT Assay, TK Assay, TK, TK Assay, TK, TK Assay, TK, TK Assay, TK, TK Assay, TK Assay, TK

Produk iphase

Pengenalan

Hati tikus yang disebabkan S9adalah komponen utama dalam menilaiKetoksikan genetikPotensi bahan kimia, terutamanya dalam toksikologi pengawalseliaan. Ia biasanya digunakan dalam kombinasi dengan ujian in vitro, sepertiUjian Ames danUjian mutasi, untuk menilai sifat mutagenik sebatian. Dengan menyediakan sistem enzimatik yang kaya dengan cytochrome P450 (CYP450), pecahan hati tikus S9 yang disebabkan memainkan peranan penting dalam mensimulasikan proses metabolik yang berlaku di hati, membantu menentukan sama ada bahan kimia berpotensi menyebabkan mutasi genetik atau kanser.

Hati tikus yang disebabkan S9

Pecahan hati S9 merujuk kepada postnatant mitokondria yang diperolehi daripada homogenat hati tikus selepas beberapa langkah sentrifugasi. Istilah "disebabkan" merujuk kepada rawatan tikus dengan sebatian tertentu yang meningkatkan aktiviti enzim hati, terutamanya enzim cytochrome P450 (CYP450), yang bertanggungjawab untuk metabolisme pelbagai jenis xenobiotik.

Pecahan hati tikus S9 yang diinduksi mengandungi pelbagai enzim yang terlibat dalam metabolisme fasa I dan Fasa II bahan kimia. Ini termasuk enzim seperti cytochrome P450 monooxygenases, yang memudahkan biotransformasi oksidatif substrat, dengan itu meniru metabolisme hati manusia.

Aktiviti CYP450 dan pengaktifan metabolik

Keluarga enzim cytochrome P450 (CYP450) memainkan peranan penting dalam metabolisme pelbagai bahan, termasuk banyak farmaseutikal, bahan kimia alam sekitar, dan karsinogen. Pecahan hati tikus S9 yang diinduksi mengandungi enzim -enzim ini dan penting untuk menilai bahan kimia yang hanya boleh menjadi genotoksik selepas pengaktifan metabolik.

Banyak sebatian pada mulanya bukan - toksik tetapi boleh menjadi toksik selepas metabolisme di hati. Pro - mutagens (yang memerlukan pengaktifan metabolik menjadi mutagenik) dan pro - karsinogen (yang memerlukan pengaktifan untuk menyebabkan kanser) hanya dapat dikesan melalui ujian yang termasuk sistem pengaktifan metabolik S9. Tanpa induksi enzim metabolik seperti CYP450, bahan -bahan ini mungkin kelihatan tidak berbahaya dalam ujian genotoksisiti standard.

Dengan menambah hati tikus S9 kepada ujian in vitro, penyelidik dapat menilai bagaimana bahan berinteraksi dengan enzim CYP450. Ini amat penting untuk farmaseutikal, kerana metabolisme oleh enzim CYP450 adalah langkah kritikal dalam farmakokinetik banyak ubat.

Aplikasi hati tikus yang disebabkan s9

1. 1. Ujian Ames (OECD 471)

Ujian Ames, yang digariskan dalam garis panduanOECD 471, adalah salah satu kaedah yang paling baik dan digunakan secara meluas untuk menilai mutagenik. Ia melibatkan mendedahkan strain bakteria Salmonella ke kimia ujian untuk melihat apakah ia mendorong mutasi yang menyebabkan bakteria kembali ke histidine - keadaan bebas.

Untuk mensimulasikan proses metabolik manusia, hati tikus yang disebabkan S9 sering ditambah kepada sistem ujian. Fraksi S9 menyediakan enzim yang diperlukan, termasuk CYP450, yang mungkin diperlukan untuk memetabolisme sebatian menjadi bentuk yang lebih reaktif yang boleh menyebabkan mutasi dalam DNA bakteria. Gabungan S9 dengan ujian AMES membolehkan penilaian yang lebih komprehensif terhadap potensi mutagenik dengan meniru mekanisme mutagenik langsung dan metabolik yang diaktifkan.

2. 2.Ujian mutasi (ujian penyimpangan kromosom, ujian micronucleus, dan lain -lain ujian in vitro)

Sebagai tambahan kepada ujian AMES, ujian mutasi biasanya digunakan untuk menilai potensi genotoksik bahan kimia. Ujian ini lebih komprehensif dalam menilai pelbagai kerosakan genetik, termasuk mutasi kromosom, mutasi gen, dan pembentukan micronuclei. Hati tikus yang diinduksi S9 digunakan dalam ujian mutasi atas sebab -sebab berikut:

Ujian Micronucleus (OECD 487)

Ujian ini mengesan pembentukan micronuclei dalam sel, yang kecil, badan extranuclear yang mengandungi serpihan kromosom atau kromosom keseluruhan yang belum dimasukkan ke dalam nukleus semasa pembahagian sel. The Ujian Micronucleusboleh mengesan clastogenic (kromosom - pecah) dan aneugenic (mempengaruhi nombor kromosom). Hati tikus yang disebabkan oleh S9 digunakan di sini untuk mengaktifkan bahan ujian secara metabolik, kerana sesetengah bahan kimia hanya menyebabkan kerosakan kromosom sebaik sahaja ia telah dimetabolisme oleh enzim hati. Fraksi S9 meningkatkan kepekaan ujian dengan mensimulasikan pengaktifan metabolik yang mungkin berlaku dalam vivo.

Ujian penyimpangan kromosom (OECD 473)

Ujian ini menilai sama ada bahan boleh menyebabkan kerosakan struktur kepada kromosom dengan mendorong rehat, penghapusan, translocations, atau jenis penyimpangan lain. Seperti ujian micronucleus,Ujian penyimpangan kromosomboleh digunakan dengan atau tanpa pengaktifan metabolik. Hati tikus yang disebabkan S9 ditambah kepada sistem ujian untuk meniru proses metabolik di hati, yang membolehkan penilaian bahan yang mungkin tidak menyebabkan kerosakan kromosom dalam bentuk asalnya tetapi boleh melakukannya selepas metabolisme hati.

Jadual 1. Pertimbangan perbandingan ujian mutasi

HPRT/HGPRT Assay (OECD 476)

DalamHPRT/HGPRT assay, budaya hamster Cina (CHO atau V79) atau sel -sel lymphoblastoid (TK6) manusia terdedah kepada kimia ujian dengan kehadiran campuran metabolik hati tikus S9 yang disebabkan, yang membekalkan enzim CYP450 yang diperlukan untuk menukar pro -mutagen ke spesies DNA -reaktif. Selepas rawatan ringkas dan tempoh ekspresi tujuh hari, sel -sel dicabar dengan 6 -thioguanine; Hanya klon yang mengandungi mutasi fungsi kehilangan dalam hypoxanthine -guanine phosphoribosyltransferase gen bertahan. Dengan membandingkan tuduhan koloni mutan kepada daya maju keseluruhan, penyelidik menentukan kekerapan mutasi yang, jika ditingkatkan semula ke atas kedua -dua kawalan serentak dan sejarah, menunjukkan potensi genotoksik.

Ujian TK (OECD 490 & OECD 476)

TheTK assay menggunakan sel limfoma tetikus L5178Y (OECD 490) atau sel CHO (OECD 476) Heterozygous direkayasa di lokus thymidine kinase. Berikutan pendedahan kimia ± S9 campuran, sel -sel pulih dan dilapisi dalam medium yang mengandungi trifluorothymidine, yang membunuh sel -sel yang berprofisi TK. Mutan Tk⁻ yang hidup membentuk koloni selama 10-14 hari, dengan mutan koloni kecil sering mencerminkan peristiwa kromosom dan mutan besar -koloni yang mencerminkan mutasi titik. Seperti dalam ujian HPRT/HGPRT, kawalan sitotoksisiti yang ketat dan penanda aras mutagen positif memastikan bahawa peningkatan kekerapan mutasi dengan pasti mencerminkan risiko genotoksik kompaun.

4. 4. Penilaian Risiko Kanser

Hati tikus yang disebabkan S9 juga digunakan dalam kajian yang bertujuan menilai kanser - menyebabkan potensi bahan. Dengan mensimulasikan proses metabolik yang berlaku di hati manusia, pecahan S9 dapat membantu mengenal pasti sebatian yang mungkin membawa kepada pembentukan metabolit reaktif yang mampu mengikat DNA dan menyebabkan mutasi yang boleh menyebabkan kanser.

Ujian Ames yang dipertingkatkan dengan hati hamster yang disebabkan S9

Menurut garis panduan terkini yang dikeluarkan oleh Agensi Ubat Eropah (EMA), ujian AMES tradisional mungkin tidak cukup sensitif untuk mengesan potensi mutagenik tertentu kekotoran nitrosamine, terutamanya n - nitrosodimethylamine (NDMA), antara lain. Oleh itu, ujian Ames yang dipertingkatkan, yang dibangunkan oleh Pusat Penyelidikan Toksikologi Kebangsaan (NCTR), pembahagian Pentadbiran Makanan dan Dadah A.S. (FDA), telah disyorkan sebagai alternatif yang lebih dipercayai. Ujian Ames yang dipertingkatkan memperkenalkan penambahan hati hamster yang disebabkan S9, yang dilakukan dalam mengandungi 30% tikus hati S9 dan 30% Hamster Hati S9. Supernatan desmosomal tikus dan hamster (S9S) harus disediakan dari hati tikus yang dirawat dengan enzim cytochrome P450 - bahan yang mendorong. Dengan menggunakan Hati Hamster S9 yang disebabkan, ujian yang dipertingkatkan ini lebih baik mensimulasikan metabolisme manusia dan meningkatkan kebolehpercayaan hasilnya.

Kesimpulan

Hati tikus yang disebabkan S9 berfungsi sebagai alat kritikal dalam ujian genotoksisiti, membantu penyelidik dan agensi pengawalseliaan menilai potensi mutagenik dan karsinogenik bahan kimia. Dengan menyediakan sistem pengaktifan metabolik, ia meningkatkan keupayaan ujian seperti ujian AMES, ujian mutasi, dan kajian aktiviti CYP450 untuk mengesan bahan yang memerlukan pengaktifan metabolik menjadi genotoksik. Aplikasinya adalah penting untuk memastikan keselamatan ubat baru, bahan kimia, dan produk pengguna. Dengan peranannya dalam mensimulasikan metabolisme hati manusia, pecahan hati S9 hati tikus terus menjadi sebahagian daripada toksikologi moden dan penilaian keselamatan pengawalseliaan.