Hepatosit Utama: Alat penting untuk memajukan penyelidikan dadah bukan klinikal

Hepatosit Utama: Alat penting untuk memajukan penyelidikan dadah bukan klinikal

Hati, sebagai organ utama untuk pendedahan dadah, memainkan peranan penting dalam metabolisme dadah dan proses ketoksikan. Hepatosit utama mempunyai spektrum penuh ciri -ciri selular dan tahap enzim dan cofactors fisiologi, termasuk membran - enzim terikat seperti cytochrome P450 (campuran oksidase dalam reticulum endoplasmik licin) Atas sebab ini, hepatosit utama dianggap sebagai standard emas untuk membina model hati in vitro dan disukai oleh penyelidik dalam interaksi dadah, metabolisme dadah, dan kajian ketoksikan. Artikel ini memberikan gambaran keseluruhan model budaya 2D dan 3D berdasarkan hepatosit utama dan aplikasi mereka dalam pembangunan dadah.

Kata kunci: hepatosit utama, penanaman 2D, penanaman 3D, organoid, co - budaya.

1. 1. Pengasingan hepatosit utama

Pengasingan hepatosit utama adalah langkah kritikal dalam mewujudkan model hati in vitro, dengan kaedah perfusi kolagenase dua langkah yang paling biasa digunakan. Dalam haiwan yang lebih kecil, perfusi hati boleh dilakukan melalui urat portal atau vena cava yang lebih rendah, sementara haiwan yang lebih besar biasanya memerlukan perfusi melalui lobus hati atau segmen. Beberapa faktor utama mempengaruhi pengasingan hepatosit yang berjaya: pertama, kolagenase harus bukan - sitotoksik. Kedua, masa pencernaan adalah penting-Kedua -duanya di bawah - pencernaan dan ke atas - pencernaan boleh berkompromi dengan hasil hepatosit dan daya maju. Ketiga, keadaan hati mestilah optimum, kerana hepatosit sangat sensitif terhadap kerosakan iskemia. Hati yang digunakan untuk penyediaan hepatosit harus disejukkan dengan cepat untuk mengurangkan kadar metabolik dan mencegah hipoksia metabolik dan iskemia berikutnya.

Piawaian untuk hepatosit utama yang digunakan dalam penyelidikan dadah adalah seperti berikut:

1. 2. Budaya 2D Hepatosit Utama

Model hepatosit penggantungan

Ia mengandungi ubat lengkap - Metabolisasi Enzim dan Cofactors, menjadikannya sesuai untuk mengkaji pelbagai laluan pelepasan metabolik. Walau bagaimanapun, daya maju hepatosit penggantungan dan aktiviti enzim metabolisme secara beransur -ansur berkurangan apabila masa inkubasi in vitro meningkat, mengehadkan masa inkubasi hingga maksimum 4 jam. Model ini biasanya digunakan untuk menganggarkan pelepasan ubat dengan kadar pelepasan yang sederhana hingga tinggi. Apabila kadar pelepasan kurang daripada 20%, nilai pelepasan yang tepat tidak dapat ditentukan. Hepatosit penggantungan tradisional - Model metabolisme in vitro tidak mencukupi untuk menghasilkan tindak balas metabolik yang dapat dikesan untuk sebatian metabolisme yang perlahan, dengan itu mengehadkan keupayaan mereka untuk meramalkan kadar pelepasan dan produk metabolik sebatian ini. Kaedah relay hepatosit penggantungan (Rajah 1) boleh digunakan untuk melanjutkan masa inkubasi hingga 20 jam atau lebih lama lagi.

Permohonan:Aktiviti enzim dan kajian kestabilan metabolik untuk ubat molekul kecil.

Rajah 1. Proses Pemindahan Kaedah Relay Hepatosit Penggantungan

Sumber: Dispos Metab Dadah, 2012,40 (9): 1860-1865

Model Hepatosit Platerase

Hepatosit utama dibiakkan dalam sistem 2D pada kolagen - plat budaya bersalut. Hepatosit mempamerkan morfologi epitel, dengan nukleus yang menonjol, sering menyampaikan dalam bentuk binucleated. Kelemahan budaya monolayer hepatosit tunggal termasuk: 1. Perubahan polariti sel dan fungsi.2. Kekurangan jenis sel lain yang berkaitan (iaitu, bukan sel parenchymal) yang diperlukan untuk fungsi normal.3. Ketidakupayaan untuk menyediakan nutrien dan faktor parakrin yang mencukupi untuk menyokong hepatosit dalam melaksanakan fungsi mereka (seperti asid hempedu dan biosintesis protein serum).

Aplikasi:

1). Penilaian Dadah - Interaksi Dadah:Ini termasuk induksi enzim, perencatan enzim, dan kajian pengangkut. Pertama, apabila ubat bertindak sebagai induk, ia boleh menyebabkan peningkatan enzim dan pengangkut metabolisme. Inducers yang kuat boleh mengimbangi pelbagai gen secara serentak, seperti induksi phenobarbital CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT, dan beberapa protein pengangkutan seperti MRP2. Kedua, terdapat spesies - Perbezaan khusus dalam bagaimana hepatosit bertindak balas terhadap induk. Sebagai contoh, rifampicin adalah inducer yang berkesan untuk hepatosit manusia dan arnab, tetapi tidak mempunyai kesan induksi pada hepatosit tikus. Akhirnya, ketumpatan penyaduran suboptimal hepatosit yang boleh dipeluakan boleh menyebabkan ekspresi basal yang dikurangkan P450s dan tindak balas induksi yang meningkat secara buatan. Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3, hepatosit pada kepadatan penyaduran yang lebih rendah menunjukkan aktiviti basal yang lebih rendah daripada CYP1A2, CYP2B6, dan CYP3A4, tetapi tindak balas induksi yang lebih kuat. Oleh itu, hepatosit yang sihat pada ketumpatan penyaduran yang sesuai adalah perlu untuk mendapatkan data yang berkaitan dengan fisiologi.

Rajah 2. Hubungan antara ketumpatan penyaduran hepatosit manusia dan induksi enzim cryopreserved

Sumber: Teknologi Penemuan Dadah Semasa, 2010, 7: 188 - 198

2). Penilaian Hepatotoxicity: Mengamati perubahan morfologi di bawah mikroskop cahaya, seperti morfologi sel, pengagregatan titisan vakum dan lipid, dan lampiran/detasmen sel. Pengesanan nekrosis hepatosit (seperti yang ditunjukkan oleh aspartate aminotransferase, laktat dehidrogenase, dan alanine aminotransferase) dan apoptosis (pemecahan DNA). Untuk sitokin - sitotoksisiti yang ditengah, budaya monolayer tunggal hepatosit tidak dapat meramalkan tindak balas toksik kerana peraturan oleh bahan -bahan yang dikeluarkan dari sel -sel parenchymal bukan jiran, seperti sel -sel kupffer, sel -sel stellate, dan sel endothelial sinusoidal.

3). "Kaedah Relay" untuk mengkaji pelepasan kompaun metabolisme yang perlahan dan metabolitnya: Aktiviti enzim metabolisme dalam hepatosit plated boleh berkurang selepas 24 jam penyaduran. Selepas mengeram hepatosit yang boleh dipilih dengan serum - medium percuma yang mengandungi sebatian minat selama 24 jam, medium dikumpulkan dan dicampur, kemudian dipindahkan ke hepatosit yang boleh dipilih untuk kajian lanjut (Rajah 3).

Rajah 3. Proses Pemindahan Kaedah Relay Hepatosit Platerable

Sumber: Surat Metabolisme Dadah, 2016, 10: 3 - 15

3). Menilai pengambilan selular, endositosis, melarikan diri endosom, dan membungkam kesan pada gen sasaran hepatosit - disasarkan ubat asid nukleik kecil.

Model penanaman sandwic

In vitro, hepatosit boleh dibiakkan di antara dua lapisan kolagen atau Matrigel untuk membina semula struktur vivo, yang dikenali sebagai penanaman sandwic. Hepatosit berbudaya di antara dua lapisan gel - kolagen (struktur sandwic) dapat meningkatkan morfologi dan daya maju sel, dan mengekalkan fungsi mereka untuk tempoh yang lebih lama. Tambahan pula, hepatosit dalam budaya sandwic dapat memulihkan polaritas, yang membolehkan penyetempatan pengangkut basolateral dan kanal yang tepat, serta pembentukan rangkaian saluran hempedu berfungsi (Rajah 4).

Rajah 4. Ekspresi pengangkut polarisasi dalam model sandwic hepatosit manusia

Sumber: Teknologi Penemuan Dadah Semasa, 2010, 7, 188 - 198

Aplikasi:

1. 1). Menganggarkan perkumuhan biliary sebatian.
2. 2). Menilai pengagihan hepatik dan biliary sebatian dan metabolit endogen dan eksogen.
3. 3). Menganggarkan pelepasan yang dimediasi oleh metabolisme dan pengangkut, dan membina fisiologi - model farmakokinetik berasaskan.
4. 4). Mempelajari hepatotoxicity dan menyediakan mekanisme untuk ubat klinikal - kecederaan hati yang disebabkan. Data disepadukan ke dalam model farmakologi sistem untuk meramalkan potensi ubat -ubatan - kecederaan hati yang disebabkan oleh manusia.
5.  
   1. 3. Budaya 3D Hepatosit Utama

6. Dalam sistem budaya 3D, hepatosit dibiakkan dalam matriks tiga - dimensi, yang lebih baik meniru seni bina hati vivo berbanding dengan budaya monolayer 2D. Sistem ini menggalakkan sel dan sel - interaksi matriks, yang boleh memulihkan lebih banyak fungsi fisiologi hati, termasuk metabolisme dadah, rembesan protein, dan pembentukan hempedu. Budaya 3D hepatosit utama boleh digunakan untuk mengkaji hati - fungsi khusus dalam vivo - seperti persekitaran, menawarkan kelebihan untuk ujian dadah, penilaian ketoksikan, dan pemodelan penyakit.

   Model Spheroid

Melalui teknik seperti Ultra - Budaya Lampiran Rendah, Budaya Drop Hanging, dan Budaya Sel Magnetik (Rajah 5), hepatosit utama boleh mengagregat menjadi agregat spheroidal dengan diameter sehingga 150 - 175 μm tanpa bergantung pada matriks luaran. Satu kelebihan budaya spheroid adalah bahawa setiap spheroid memerlukan hanya 1,330 - 2,000 sel, dengan ketara mengurangkan jumlah sel berbanding dengan teknik budaya 3D yang lain. Kajian baru -baru ini telah menunjukkan bahawa budaya spheroid hepatosit utama dapat bertahan sehingga 5 minggu, dengan aktiviti enzim CYP yang tinggal hampir tidak berubah antara hari ke -8 dan hari 35. Analisis proteomik mendedahkan bahawa, berbanding dengan budaya sandwic, enzim yang bertanggungjawab untuk penyerapan dadah, pengedaran, metabolisme, dan perkumuhan yang lebih baik untuk 14 hari yang lebih baik untuk dikhususkan selama 14 hari. Walau bagaimanapun, hati jauh lebih kompleks daripada agregat sel. Bahagian basolateral hepatosit berinteraksi dengan darah, sementara hempedu mengalir keluar dari sisi apikal, yang merupakan ciri utama struktur lobule hati yang kompleks, dan ini belum dapat direplikasi dalam model spheroid.

Aplikasi:

1. 1). Kajian pelepasan kompaun metabolisme perlahan dan metabolitnya.
2. 2). Penyelidikan Hepatotoxicity.
3. 3). Penilaian pengambilan selular, endositosis, melarikan diri endosom, dan membungkam kesan pada gen sasaran hepatosit - disasarkan ubat asid nukleik kecil.

Rajah 5. Kaedah Budaya Spheroid

Model organoid hati

Takrif konsensus organoid adalah: struktur 3D yang diperolehi dari sel stem, sel -sel progenitor, atau sel -sel yang dibezakan, yang mampu menghasilkan semula fungsi dan struktur tertentu tisu asli dalam vitro, dengan berkesan meniru kawasan mikro dan sel vivo. Organoid hati telah dikenalpasti sebagai model yang paling maju untuk penyelidikan biologi hati manusia.

Sumber sel untuk pembinaan organoid hati:

① Sel Stem Pluripotent (PSCs):

Sel stem embrio (ESCS) dan sel stem pluripotent yang disebabkan (IPSC) mempunyai pluripotensi tinggi, kepekaan, dan kapasiti proliferatif yang tidak terhad. Di bawah pengaruh faktor isyarat tertentu, mereka membezakan ke dalam hepatosit - seperti sel dengan aktiviti dan fungsi. Walau bagaimanapun, organoid hati yang diperolehi daripada PSC mungkin menjalani perubahan epigenetik dan genetik, mempamerkan perubahan aneuploidy kromosom semasa penguatan.

Aplikasi:

1. 1). Model penyakit hati genetik
2. 2). Model penyakit hati berjangkit
3. 3). Ujian sitotoksis dadah

② Tisu hati - Sel yang diperolehi: Ini termasuk cholangiocytes dan hepatosit. Hepatosit matang mengekalkan potensi sel stem dan keupayaan proliferatif dalam persekitaran tertentu. Berbanding dengan PSC - organoid yang diperolehi, organoid yang diperolehi dari tisu utama lebih matang, dengan genom yang lebih stabil, dan mengekalkan kestabilan fenotip dan genetik selama jangka panjang - budaya in vitro. Walau bagaimanapun, kapasiti proliferatif jangka panjang organoid hepatosit manusia yang matang adalah terhad berbanding hepatosit manusia janin atau hepatosit utama tikus dewasa. Mengulas organoid hepatosit dewasa masih mencabar.

Kaedah Kebudayaan (Rajah 6): Tisu hati dicerna ke dalam sel tunggal, dan campuran matrigel dan sel -sel dibiakkan dalam plat 24 - baik untuk membentuk struktur kubah - berbentuk. Inkubasi dalam inkubator budaya sel (37 ° C) selama 15 minit. Selepas pemejalan, tambah medium budaya tertentu. Petikan selepas kira -kira 14 hari. Gantikan medium asal dengan medium pembezaan selepas 7 - 10 hari.

Aplikasi:

1. 1). Model Hepatotoxicity
2. 2). Kajian gangguan metabolisme in vitro
3. 3). Penyakit hati berlemak yang tidak beralkohol
4. 4). Pembangunan dadah untuk penyakit hati yang jinak dan ganas

Rajah 6. Proses Kebudayaan dan Laluan Tisu - Organoid Hati yang Diri

Sumber: Sel & Biosains (2023) 13: 197

Perbandingan budaya spheroid dan budaya organoid

4. Hepatosit utama Co - Model Budaya

1. 1. CO Hepatosit Utama 2D - Model Budaya
      

      Dalam model hepatosit utama 2D, model budaya, dua atau lebih jenis sel yang berbeza dicampur dan dibiakkan dalam persekitaran dua dimensi. Ciri utama model ini adalah interaksi langsung antara jenis sel yang berbeza, interaksi antara sel dan matriks ekstraselular, atau penghantaran isyarat tidak langsung melalui sitokin dan komunikasi kimia. Fungsi hepatosit utama, seperti pengeluaran albumin dan keupayaan metabolisme dadah, boleh dikekalkan selama tiga minggu.

      Aplikasi:

      1. 1). Hepatosit utama Co - dibudidayakan dengan fibroblas: Model ini digunakan untuk mengkaji kadar pelepasan yang perlahan - metabolisme dan metabolit mereka.
      2. 2). Hepatosit utama CO - dibudidayakan dengan sel hati bukan parenchymal (mis., Sel -sel stellate, sel endothelial sinusoidal): Model ini berguna untuk meneliti kecederaan hati yang disebabkan oleh ubat -ubatan (DILI), kerana ia membantu untuk menyiasat peranan sitokin, chemokines, dan faktor pertumbuhan dalam modulasi tindak balas hati.
      3. 3). Hepatosit utama Co - dibudidayakan dengan sel T: Model ini digunakan untuk mengesan metabolisme ubat hati - Tanggapan sel T khusus.
      4. 4). Iphase's Hepatomax ™CO - Sistem Budaya: iPhase telah membangunkan sistem budaya Co - dengan hepatosit utama dari spesies yang berbeza, yang dikenali sebagai hepatomax™. Oleh CO - Kultur hepatosit utama manusia dengan sel -sel stromal, adalah mungkin untuk mengekalkan ubat enzim yang baik - metabolisasi aktiviti enzim dalam hepatosit manusia sehingga 3 minggu. Sistem ini sesuai untuk mengkaji kadar pelepasan kompaun yang perlahan - metabolisme dan metabolit mereka.

      Model budaya CO - ini menyediakan platform yang lebih fisiologi yang relevan untuk menilai metabolisme dadah, ketoksikan, dan hati - Proses penyakit yang berkaitan, menawarkan pandangan tentang bagaimana jenis sel yang berbeza menyumbang kepada fungsi dan penyakit hati.
      
      

      Hepatosit Utama 3d Model Budaya

      Direct 3D Co - Budaya: Model ini melibatkan pencampuran dua atau lebih jenis sel hati (mis., Hepatosit utama, sel endothelial sinusoidal, sel stellate hepatik, sel -sel kupffer) untuk membentuk diri sendiri CO 3D Direct - Budaya membolehkan interaksi rapat antara sel -sel hati yang berbeza melalui mekanisme seperti sel - ke - melekat sel, isyarat paracrine melalui sitokin larut, dan lekatan matriks ekstraselular, membolehkan komunikasi antara hepatosit.

      Aplikasi:

      1. 1). Model Fibrosis Hati: Digunakan untuk mengkaji mekanisme dan perkembangan fibrosis hati.
      2. 2). Model kecederaan hati (DILI) yang disebabkan: membantu mensimulasikan dan menilai kerosakan hati yang disebabkan oleh ubat.
      3. 3). Interaksi dadah, metabolisme dadah, dan induksi enzim: Menilai bagaimana ubat -ubatan yang berlainan berinteraksi, bagaimana ia dimetabolisme, dan bagaimana mereka mendorong enzim hati.

      CO 3D tidak langsung - Kebudayaan: Kaedah ini menggunakan sistem pemisahan fizikal (mis., Transwell atau bahan lain) kepada budaya dua atau lebih jenis sel (seperti hepatosit utama dengan sel NIH/3T3 atau sel endothelial sinusoidal) dalam persekitaran 3D, di mana sel langsung - ke - sentuhan sel dicegah. Komunikasi antara sel berlaku melalui sitokin larut.

      Aplikasi:
      Digunakan untuk mengkaji bukan - komunikasi hubungan antara sel hati di dalam badan.

      
      Ringkasnya, Iphase, sebagai pemimpin dalam penyelidikan biologi in vitro, menyediakan penyelesaian yang komprehensif untuk ujian ubat bukan klinikal. Dari pengasingan dan budaya hepatosit utama dari pelbagai spesies kepada pembangunan produk sokongan seperti media kultur untuk aplikasi tertentu atau pelbagai - spesifikasi kolagen - plat bersalut, iPhase didedikasikan untuk menawarkan alat penyelidikan in vitro terbaik untuk penemuan dan pembangunan dadah. Kami adalah rakan kongsi yang dipercayai untuk pelanggan dalam industri farmaseutikal, yang komited untuk menyediakan penyelesaian kelebihan untuk penyelidikan klinikal.