Epatokiti primarji: għodda kruċjali għall-avvanz ta 'riċerka dwar il-mediċina in vitro mhux klinika

Epatokiti primarji: għodda kruċjali għall-avvanz ta 'riċerka dwar il-mediċina in vitro mhux klinika

Il-fwied, bħala l-organu primarju għall-esponiment għall-mediċina, għandu rwol kruċjali fil-metaboliżmu tad-droga u l-proċessi ta 'tossiċità. L-epatokiti primarji għandhom l-ispettru sħiħ ta 'karatteristiċi ċellulari u livelli fiżjoloġiċi ta' enzimi u kofatturi, inkluża l-enzimi marbuta bħal ċitokromu P450 (funzjoni mħallta - funzjoni fl-ossidase fir-retikolu endoplasmiku bla xkiel) u esterases ċitosoliċi, li joħorġu fil-front metaboliċi kollha misjuba fil-fwied. Għal din ir-raġuni, l-epatokiti primarji huma ġeneralment meqjusa bħala l-istandard tad-deheb għall-kostruzzjoni ta 'mudelli tal-fwied in vitro u huma favoriti minn riċerkaturi fl-interazzjoni tad-droga, metaboliżmu tad-droga, u studji ta' tossiċità. Dan l-artikolu jipprovdi ħarsa ġenerali lejn mudelli ta 'kultura 2D u 3D ibbażati fuq epatokiti primarji u l-applikazzjonijiet tagħhom fl-iżvilupp tad-droga.

Keywords: epatokiti primarji, kultivazzjoni 2D, kultivazzjoni 3D, organoids, ko-kultura.

1. 1. L-iżolament tal-epatokiti primarji

L-iżolament tal-epatokiti primarji huwa pass kritiku fl-istabbiliment ta 'mudelli tal-fwied in vitro, biż-żewġ metodu ta' perfużjoni tal-collagenase tal-collagenase huwa l-iktar użat. F'annimali iżgħar, perfużjoni tal-fwied tista 'titwettaq permezz tal-vina portal jew vena cava inferjuri, filwaqt li annimali akbar tipikament jeħtieġu perfużjoni permezz ta' lobi tal-fwied jew segmenti. Bosta fatturi ewlenin jinfluwenzaw l-iżolament b'suċċess ta 'epatokiti: l-ewwel, il-kollaġenasi għandha tkun mhux ċitotossika. It-tieni, iż-żmien tad-diġestjoni huwa kruċjali -Kemm taħt - diġestjoni u aktar - Id-diġestjoni tista 'tikkomprometti r-rendiment u l-vijabbiltà tal-epatokiti. It-tielet, il-kundizzjoni tal-fwied trid tkun ottima, minħabba li l-epatokiti huma sensittivi ħafna għall-ħsara iskemika. Il-fwied użat għall-preparazzjoni tal-epatokiti għandu jitkessaħ malajr biex jitnaqqas ir-rati metaboliċi u jipprevjeni ipoksja metabolika u iskemija sussegwenti.

L-istandards għall-epatokiti primarji użati fir-riċerka tad-droga huma kif ġej:

1. 2. Kultura 2D tal-Epatokiti Primarji

Il-mudell tal-epatokiti tas-sospensjoni

Fih mediċina kompluta - metabolizzazzjoni ta 'enżimi u kofatturi, li tagħmilha xierqa għall-istudju ta' diversi mogħdijiet ta 'tneħħija metabolika. Madankollu, il-vijabbiltà tal-epatokiti tas-sospensjoni u l-attività tal-mediċina - metabolizzazzjoni tal-enzimi tonqos gradwalment hekk kif il-ħin tal-inkubazzjoni in vitro jiżdied, u jillimita l-ħin tal-inkubazzjoni għal massimu ta '4 sigħat. Dan il-mudell huwa tipikament użat biex jistma t-tneħħija tal-mediċini b'rati moderati għal ta 'tneħħija għoljin. Meta r-rata ta 'tneħħija tkun inqas minn 20%, ma jistgħux jiġu ddeterminati valuri preċiżi ta' tneħħija. Epatokiti ta 'sospensjoni tradizzjonali - Il-mudelli ta' metaboliżmu in vitro bbażati mhumiex biżżejjed biex jiġġeneraw reazzjonijiet metaboliċi li jinstabu għal komposti bil-mod - metabolizzazzjoni, u b'hekk jillimitaw il-kapaċità tagħhom li jbassru r-rati ta 'approvazzjoni u l-prodotti metaboliċi ta' dawn il-komposti. Metodu ta 'relay tal-epatokiti ta' sospensjoni (Figura 1) jista 'jintuża biex jestendi l-ħin ta' inkubazzjoni għal 20 siegħa jew saħansitra itwal.

Applikazzjoni:Attività ta 'enżimi u studji ta' stabbiltà metabolika għal mediċini ta 'molekula żgħira.

Figura 1. Sospensjoni tal-Proċess tat-Trasferiment tal-Metodu tal-Epatokiti

Sors: Droga Metab Dispos, 2012,40 (9): 1860-1865

Il-mudell tal-epatokiti platibbli

Epatokiti primarji huma kkultivati ​​f'sistema 2D fuq pjanċi tal-kultura miksija bil-kollaġen. L-epatokiti juru morfoloġija epiteljali, b'nuklei li joħorġu, li ħafna drabi jippreżentaw f'forma binukleata. L-iżvantaġġi tal-kultura monostrata tal-epatokiti singoli jinkludu: 1. Alterazzjoni tal-polarità taċ-ċellula u l-funzjoni.2. Nuqqas ta 'tipi oħra ta' ċelloli rilevanti (i.e., ċelloli mhux parenchymal) li huma meħtieġa għall-funzjoni normali.3. L-inkapaċità li tipprovdi biżżejjed nutrijenti u fatturi paracrine biex tappoġġja l-epatokiti fit-twettiq tal-funzjonijiet tagħhom (bħal aċidu tal-bili u bijosintesi tal-proteina fis-serum).

Applikazzjonijiet:

1). Evalwazzjoni tal-mediċina - Interazzjonijiet tad-Droga:Dan jinkludi induzzjoni ta 'enzimi, inibizzjoni ta' enzimi, u studji ta 'trasportatur. L-ewwelnett, meta mediċina taġixxi bħala induttur, tista 'twassal għal espressjoni miżjuda ta' droga - metabolizzazzjoni ta 'enzimi u trasportaturi. Indutturi qawwija jistgħu jirregolaw ġeni multipli fl-istess ħin, bħal induzzjoni fenobarbitali ta 'CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT, u diversi proteini tat-trasport bħal MRP2. It-tieni, hemm speċi - differenzi speċifiċi fil-mod kif l-epatokiti jirrispondu għall-indutturi. Pereżempju, rifampicin huwa induttur effettiv għall-epatokiti umani u tal-fenek, iżda m'għandu l-ebda effett ta 'induzzjoni fuq l-epatokiti tal-far. Fl-aħħarnett, id-densità tal-plating mhux ottimali ta 'epatokiti plateabbli tista' twassal għal espressjoni bażali mnaqqsa ta 'P450s u żiedu r-risponsi ta' induzzjoni artifiċjalment. Kif muri fil-Figura 3, l-epatokiti f'densitajiet ta 'plating aktar baxxi juru attività bażali aktar baxxa ta' CYP1A2, CYP2B6, u CYP3A4, iżda risponsi ta 'induzzjoni aktar b'saħħithom. Għalhekk, epatokiti b'saħħithom f'densità ta 'plating xierqa huma meħtieġa biex tinkiseb dejta fiżjoloġikament rilevanti.

Figura 2

Sors: Teknoloġiji attwali ta 'Discovery Drug, 2010, 7: 188 - 198

2). Valutazzjoni tal-Epatotossiċità: Osservazzjoni ta 'bidliet morfoloġiċi taħt mikroskopju ħafif, bħal morfoloġija taċ-ċelluli, aggregazzjoni tal-qtar tal-vakuol u tal-lipidi, u t-twaħħil / stakkament taċ-ċelluli. Sejbien ta 'nekrożi tal-epatokiti (kif indikat minn aspartate aminotransferase, lactate dehydrogenase, u alanine aminotransferase) u apoptożi (frammentazzjoni tad-DNA). Għal ċitokina - ċitotossiċità medjata, kulturi monostrati singoli ta 'epatokiti ma jistgħux ibassru risponsi tossiċi minħabba r-regolazzjoni minn sustanzi rilaxxati miċ-ċelloli mhux parenċimali ġirien, bħal ċelloli Kupffer, ċelloli stellati, u ċelloli endoteljali sinusojdali.

3). "Metodu tar-Relay" għall-istudju ta 'tneħħija tal-kompost metabolizzanti bil-mod u l-metaboliti tiegħu: L-attività tal-mediċina - metabolizzazzjoni ta 'enzimi f'epatokiti plateabbli tibda tonqos wara 24 siegħa ta' plating. Wara l-inkubazzjoni tal-epatokiti plateabbli bis-serum - mezz ħieles li fih il-kompost ta 'interess għal 24 siegħa, il-mezz jinġabar u jitħallat, imbagħad jiġi trasferit għal epatokiti ġodda plateabbli għal aktar studju (Figura 3).

Figura 3

Sors: Ittri tal-Metaboliżmu tad-Droga, 2016, 10: 3 - 15

3). Evalwa l-assorbiment ċellulari, l-endokitosi, il-ħarba endosomali, u l-effetti tas-silenzju fuq il-ġene fil-mira ta 'l-epatokiti - mediċini ta' aċidu nuklejku żgħir immirat.

Mudell ta 'kultivazzjoni sandwich

In vitro, l-epatokiti jistgħu jiġu kkultivati ​​bejn żewġ saffi ta 'kollaġen jew matrigel biex jibnu mill-ġdid strutturi in vivo, magħrufa bħala l-kultivazzjoni sandwich. Epatokiti kkultivati ​​bejn żewġ saffi ta 'ġel - kollaġen (struttura sandwich) jistgħu jtejbu l-morfoloġija u l-vijabbiltà taċ-ċelloli, u jżommu l-funzjonalità tagħhom għal perjodu itwal. Barra minn hekk, l-epatokiti fil-kultura sandwich jistgħu jirrestawraw il-polarità, li jippermettu lokalizzazzjoni xierqa ta 'trasportaturi basolaterali u kanalikulari, kif ukoll il-formazzjoni ta' netwerks funzjonali tal-kanali tal-bili (Figura 4).

Figura 4. Espressjoni polarizzata ta 'trasportaturi fil-mudell sandwich tal-epatokiti umani

Sors: Teknoloġiji ta 'Discovery Droga attwali, 2010, 7, 188 - 198

Applikazzjonijiet:

1. 1). Stima ta 'eskrezzjoni biljari ta' komposti.
2. 2). L-evalwazzjoni tad-distribuzzjoni tal-fwied u biljari ta 'komposti u metaboliti endoġeni u eżoġeni.
3. 3). Stima tat-tneħħija medjata mill-metaboliżmu u t-trasportaturi, u l-kostruzzjoni ta 'fiżjoloġija - mudelli farmakokinetiċi bbażati.
4. 4). Studju tal-epatotossiċità u li tipprovdi mekkaniżmi għal mediċina klinika - korriment tal-fwied indott. Id-dejta hija integrata fil-mudelli tal-farmakoloġija tas-sistemi biex tbassar mediċina potenzjali - korriment tal-fwied indott fil-bnedmin.
5.  
   1. 3. Kultura Primarja tal-Epatokiti 3D

6. Fis-sistemi tal-kultura 3D, l-epatokiti huma kkultivati ​​fi tliet matriċi dimensjonali, li jimitaw aħjar l-arkitettura tal-fwied in vivo meta mqabbla ma 'kulturi monostrati 2D. Dawn is-sistemi jippromwovu l-interazzjonijiet taċ-ċellula u ċ-ċellula - matriċi, li jistgħu jirrestawraw aktar mill-funzjonijiet fiżjoloġiċi tal-fwied, inkluż il-metaboliżmu tad-droga, is-sekrezzjoni tal-proteina, u l-formazzjoni tal-bili. Kulturi 3D tal-epatokiti primarji jistgħu jintużaw biex jistudjaw il-fwied - funzjonijiet speċifiċi f'ambjent aktar in vivo - bħal, joffru vantaġġi għall-ittestjar tad-droga, valutazzjoni tat-tossiċità, u l-immudellar tal-mard.

   Mudell ta 'Sferojdi

Permezz ta 'tekniki bħal kultura ta' sekwestru ultra - baxx, kultura ta 'qatra mdendlin, u kultura taċ-ċelluli manjetiċi (Figura 5), ​​l-epatokiti primarji jistgħu jinġabru f'aggregati sferojdi b'dijametru ta' sa 150 - 175 µm mingħajr ma jiddependu fuq matriċi esterni. Vantaġġ wieħed tal-kultura sferojde huwa li kull sferojde jirrikjedi biss 1,330 - 2,000 ċelloli, li jnaqqas b'mod sinifikanti n-numru ta 'ċelloli meta mqabbel ma' tekniki oħra tal-kultura 3D. Studji riċenti wrew li l-kulturi primarji ta 'l-isferojdi tal-epatokiti jistgħu jsostnu sa 5 ġimgħat, bl-attività ta' enzimi CYP tibqa 'kważi l-istess bejn il-jum 8 u l-jum 35. L-analiżi tal-proteomiċi żvelat li, meta mqabbel mal-kultura sandwich, enżimi responsabbli għall-assorbiment tad-droga, distribuzzjoni, metaboliżmu, u skrezzjoni huma preservati aħjar għal 14-il ġurnata fil-kultura spirojde. Madankollu, il-fwied huwa ħafna iktar kumpless minn aggregat taċ-ċellula. In-naħa basolaterali ta 'l-epatokiti tinteraġixxi mad-demm, filwaqt li l-bili joħroġ min-naħa apikali, li hija karatteristika ewlenija tal-istruttura kumplessa tal-lobuli tal-fwied, u dan għadu ma jistax jiġi replikat fil-mudell sferojde.

Applikazzjonijiet:

1. 1). Studju ta 'tneħħija tal-kompost metabolizzanti bil-mod u l-metaboliti tiegħu.
2. 2). Riċerka dwar l-Epatotossiċità.
3. 3). Evalwazzjoni ta 'l-assorbiment ċellulari, l-endokitosi, il-ħarba endosomali, u l-effetti tas-silenzju fuq ġeni fil-mira ta' l-epatokiti - mediċini ta 'aċidu nuklejku żgħir immirat.

Figura 5. Metodu tal-Kultura tal-Isferojdi

Mudell ta 'organoids tal-fwied

Id-definizzjoni ta 'kunsens ta' organoids hija: strutturi 3D derivati ​​minn ċelloli staminali, ċelloli tal-proġenituri, jew ċelloli differenzjati, li kapaċi jirriproduċu ċerti funzjonijiet u strutturi tat-tessut nattiv in vitro, li jimitaw b'mod effettiv il-mikroambjent in vivo u l-interazzjonijiet taċ-ċelluli - għal - għal - għal ċelloli. Organoids tal-fwied ġew identifikati bħala l-aktar mudell avvanzat għar-riċerka tal-bijoloġija tal-fwied uman.

Sorsi taċ-ċelloli għall-kostruzzjoni organoid tal-fwied:

① Ċelloli staminali pluripotenti (PSCs):

Ċelloli staminali embrijoniċi (ESCs) u ċelloli staminali pluripotenti indotti (iPSCs) għandhom pluripotenza għolja, plastiċità u kapaċità proliferattiva illimitat. Taħt l-influwenza ta 'fatturi ta' sinjalazzjoni speċifiċi, huma jiddifferenzjaw f'epatokiti - bħal ċelloli b'attività u funzjoni. Madankollu, organoids tal-fwied derivati ​​minn PSCs jistgħu jgħaddu minn alterazzjonijiet epigenetiċi u ġenetiċi, li juru bidliet ta 'aneuploidy kromożomali waqt l-amplifikazzjoni.

Applikazzjonijiet:

1. 1). Mudelli ġenetiċi ta 'mard tal-fwied
2. 2). Mudelli ta 'mard tal-fwied infettiv
3. 3). Ittestjar taċ-ċitotossiċità tal-mediċina

② Tessut tal-fwied - ċelloli derivati: Dawn jinkludu cholangiocytes u epatokiti. Epatokiti maturi jżommu l-potenzjal taċ-ċelloli staminali u l-abilità proliferattiva f'ambjenti speċifiċi. Meta mqabbel ma 'organoids derivati ​​minn PSC, organoids derivati ​​minn tessut primarju huma aktar maturi, b'ġenomi aktar stabbli, u jżommu stabbiltà fenotipika u ġenetika matul il-kultura fit-tul ta' żmien in vitro. Madankollu, il-kapaċità proliferattiva fit-tul ta 'organojdi tal-epatokiti umani maturi hija limitata meta mqabbla ma' epatokiti umani tal-fetu jew epatokiti primarji tal-ġurdien adulti. Il-kultivazzjoni ta 'organojdi ta' l-epatokiti adulti tibqa 'ta' sfida.

Metodu tal-Kultura (Figura 6): It-tessut tal-fwied huwa diġerit f'ċelloli singoli, u taħlita ta 'matrigel u ċelloli hija miżrugħa fi pjanċa ta' 24 - bir biex tifforma koppla - strutturi b'forma. Inkuba f'inkubatur tal-kultura taċ-ċellula (37 ° C) għal 15-il minuta. Wara s-solidifikazzjoni, żid mezz ta 'kultura speċifiku. Passaġġ wara madwar 14-il jum. Ibdel il-mezz oriġinali b'mezz ta 'differenzjazzjoni wara 7 - 10 ijiem.

Applikazzjonijiet:

1. 1). Mudelli ta 'epatotossiċità
2. 2). Studji ta 'disturb fil-metaboliżmu in vitro
3. 3). Mard tal-fwied xaħmi mhux alkoħoliku
4. 4). Żvilupp tad-droga għal mard tal-fwied beninni u malinni

Figura 6. Kultura u proċess ta 'passaġġ ta' tessut - organoids tal-fwied derivati

Sors: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

Tqabbil tal-kultura sferojde u l-kultura organojdi

4. Mudell tal-Kultura Primarju tal-Epatokiti

1. 1. 2d Primary Hepatocyte Co - Mudell tal-Kultura
      

      Fil-mudell tal-kultura tal-hepatocyte primarja 2D, żewġ tipi ta 'ċelloli jew aktar differenti huma mħallta u kkultivati ​​f'ambjent ta' żewġ - dimensjonali. Il-karatteristika ewlenija ta 'dan il-mudell hija l-interazzjoni diretta bejn tipi ta' ċelloli differenti, l-interazzjoni bejn iċ-ċelloli u l-matriċi extraċellulari, jew it-trasmissjoni tas-sinjal indirett permezz ta 'ċitokini u komunikazzjonijiet kimiċi. Funzjonijiet primarji tal-epatokiti, bħall-produzzjoni tal-albumina u l-abilità tal-metaboliżmu tad-droga, jistgħu jinżammu sa tliet ġimgħat.

      Applikazzjonijiet:

      1. 1). Epatokiti primarji ko - ikkultivati ​​bil-fibroblasti: Dan il-mudell jintuża għall-istudju tar-rata ta 'tneħħija ta' komposti bil-mod - metabolizzanti u l-metaboliti tagħhom.
      2. 2). Epatokiti primarji CO - ikkultivati ​​b'ċelloli tal-fwied mhux - parenchymal (per eżempju, ċelloli stellati, ċelloli endoteljali sinusojdali): Dan il-mudell huwa utli għar-riċerka dwar il-mediċina - korriment tal-fwied indott (DILI), billi jgħin biex jinvestiga r-rwol ta 'ċitokini, kimokokini, u fatturi ta' tkabbir fil-modulazzjoni ta 'reazzjonijiet adattivi tal-fwied wara l-espożizzjoni tad-droga.
      3. 3). Epatokiti primarji ko - ikkultivati ​​maċ-ċelloli T: Dan il-mudell jintuża biex jikxef il-metaboliżmu tal-mediċina tal-fwied - risponsi speċifiċi taċ-ċelloli T.
      4. 4). Iphase's Hepatomax ™Ko - Sistema tal-Kultura: Iphase żviluppat sistema ta 'kultura ta' ko-hepatocytes minn speċi differenti, magħrufa bħala Hepatomax™- Permezz tal-ko-kultivazzjoni tal-epatokiti primarji umani maċ-ċelloli stromali, huwa possibbli li tinżamm mediċina tajba - metabolizzazzjoni tal-attività tal-enzimi fl-epatokiti umani għal 3 ġimgħat. Din is-sistema hija adattata għall-istudju bil-mod - metabolizzazzjoni tar-rati ta 'tneħħija tal-kompost u l-metaboliti tagħhom.

      Dan il-mudell ta 'kultura ko-jipprovdi pjattaforma aktar fiżjoloġikament rilevanti għall-evalwazzjoni tal-metaboliżmu tad-droga, tossiċità, u proċessi ta' mard relatati mal-fwied, u joffri għarfien dwar kif tipi ta 'ċelloli differenti jikkontribwixxu għall-funzjoni tal-fwied u l-mard.
      
      

      Mudell tal-Kultura tal-Epatokiti Primarji 3D 3D

      Dirett 3D Co - Kultura: Dan il-mudell jinvolvi t-taħlit ta 'żewġ tipi jew aktar differenti ta' ċelloli tal-fwied (per eżempju, epatokiti primarji, ċelloli endoteljali sinusojdali, ċelloli stellati tal-fwied, ċelloli Kupffer) biex jiffurmaw awto - sferojdi mmuntati jew li jikkultivawhom f'ambjent 3D mibni b'materjali bħal collagen, fibrin, alginat, jew hydrogels. Il-kultura diretta 3D CO tippermetti interazzjoni mill-qrib bejn ċelloli tal-fwied differenti bħal mekkaniżmi bħal ċelloli - sa - adeżjoni taċ-ċellula, sinjalazzjoni paracrine permezz ta 'ċitokini li jinħallu, u adeżjoni ta' matriċi extraċellulari, li tippermetti komunikazzjoni bejn l-epatokiti.

      Applikazzjonijiet:

      1. 1). Mudell tal-fibrożi tal-fwied: Użat biex jistudja l-mekkaniżmi u l-progressjoni tal-fibrożi tal-fwied.
      2. 2). Droga - Mudell ta 'Korriment tal-Fwied indott (DILI): Jgħin biex jissimula u jivvaluta l-ħsara fil-fwied ikkawżat mid-drogi.
      3. 3). L-interazzjonijiet tad-droga, il-metaboliżmu tad-droga, u l-induzzjoni tal-enzimi: jevalwaw kif il-mediċini differenti jinteraġixxu, kif huma metabolizzati, u kif jikkaġunaw enzimi tal-fwied.

      Kultura Indiretta 3D CO -: Dan il-metodu juża sistema ta 'separazzjoni fiżika (per eżempju, Transwell jew materjali oħra) biex tikkalkula żewġ tipi jew aktar ta' ċelloli (bħal epatokiti primarji b'ċelluli NIH / 3T3 jew ċelloli endoteljali sinusojdali) f'ambjent 3D, fejn ċellola diretta - sa - il-kuntatt taċ-ċellula huwa evitat. Il-komunikazzjoni bejn iċ-ċelloli sseħħ permezz ta 'ċitokini li jinħallu.

      Applikazzjonijiet:
      Użat għall-istudju ta 'komunikazzjoni mhux ta' kuntatt bejn ċelloli tal-fwied fil-ġisem.

      
      Fil-qosor, iPhase, bħala mexxej fir-riċerka bijoloġika in vitro, tipprovdi soluzzjonijiet komprensivi għall-ittestjar tal-mediċina mhux klinika. Mill-iżolament u l-kultura ta 'epatokiti primarji minn speċi varji għall-iżvilupp ta' prodotti ta 'sostenn bħal midja tal-kultura għal applikazzjonijiet speċifiċi jew pjanċi multi-speċifikazzjoni tal-kollaġen, iPhase hija ddedikata biex toffri l-aħjar għodod ta' riċerka in vitro għall-iskoperta u l-iżvilupp tad-droga. Aħna sieħeb ta 'fiduċja għall-klijenti fl-industrija farmaċewtika, impenjati li nipprovdu soluzzjonijiet ta' qtugħ - tarf għal riċerka mhux klinika.