Indukowana frakcja S9 wątroby szczura: system aktywacji metabolicznej dla genotoksyczności i mutacji in vitro

Słowa kluczowe: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, Test mutacji, genotoksyczność, toksyczność genetyczna, indukowana wątroba szczura S9, test AMES, test mini ames, aberracja chromosomalna, mikronukleus, HPRT/HGPRT Assay, TK Asand

Produkt iPhase

Wstęp

Indukowana wątroba szczura S9jest kluczowym elementem ocenytoksyczność genetycznaPotencjał chemikaliów, szczególnie w toksykologii regulacyjnej. Jest powszechnie stosowany w połączeniu z testami in vitro, takimi jakTest Ames ITesty mutacji, w celu oceny właściwości mutagennych związków. Zapewniając układ enzymatyczny bogaty w cytochrom P450 (CYP450), indukowana frakcja S9 w wątrobie szczura odgrywa kluczową rolę w symulacji procesów metabolicznych występujących w wątrobie, pomagając ustalić, czy chemikalia mogą potencjalnie powodować mutacje genetyczne lub raka.

Indukowana wątroba szczura S9

Frakcja wątroby S9 odnosi się do supernatantu mitochondrialnego uzyskanego z homogenatów wątroby szczura po serii etapów wirowania. Termin „indukowany” odnosi się do leczenia szczurów specyficznymi związkami, które wzmacniają aktywność enzymów wątroby, szczególnie enzymów cytochromu P450 (CYP450), które są odpowiedzialne za metabolizm szerokiego zakresu ksenobiotyków.

Indukowana frakcja S9 wątroby szczura zawiera różne enzymy zaangażowane w metabolizm fazy I i fazy II chemikaliów. Obejmuje to enzymy, takie jak monooksygenazy P450 P450, które ułatwiają utleniającą biotransformację substratów, naśladując w ten sposób metabolizm ludzkiej wątroby.

Aktywność CYP450 i aktywacja metaboliczna

Rodzina enzymów cytochromu P450 (CYP450) odgrywa kluczową rolę w metabolizmie szerokiej gamy substancji, w tym wielu farmaceutycznych, chemikaliów środowiskowych i rakotwórczych. Indukowana frakcja S9 wątroby szczura zawiera te enzymy i jest niezbędna do oceny chemikaliów, które mogą stać się genotoksyczne dopiero po aktywacji metabolicznej.

Wiele związków jest początkowo toksycznych, ale może stać się toksyczne po metabolizmie w wątrobie. Te pro - mutagenów (które wymagają aktywacji metabolicznej, aby stać się mutagennym) i pro - rakotwórcze (które wymagają aktywacji w celu spowodowania raka) można wykryć tylko za pomocą testów obejmujących system aktywacji metabolicznej S9. Bez indukcji enzymów metabolicznych, takich jak CYP450, substancje te mogą wydawać się nieszkodliwe w standardowych testach genotoksyczności.

Dodając indukowaną wątrobę szczura S9 do testów in vitro, naukowcy mogą ocenić, w jaki sposób substancja oddziałuje z enzymami CYP450. Jest to szczególnie ważne w przypadku farmaceutyków, ponieważ metabolizm przez enzymy CYP450 jest kluczowym krokiem w farmakokinetyce wielu leków.

Zastosowania indukowanej wątroby szczura S9

1. 1. Test Ames (OECD 471)

Test AMES, opisany w wytycznychOECD 471, jest jedną z najbardziej znanych i szeroko stosowanych metod oceny mutagenności. Obejmuje odsłonięcie szczepów bakterii Salmonella na testową substancję chemiczną, aby sprawdzić, czy indukuje mutacje, które powodują, że bakterie powrócą do stanu niezależnego histydyny.

Aby symulować ludzki proces metaboliczny, do systemu testowego często dodaje się indukowana wątroba szczura. Frakcja S9 zapewnia niezbędne enzymy, w tym CYP450, które mogą być wymagane do metabolizacji związku w bardziej reaktywną postać, która może powodować mutacje w bakteryjnym DNA. Ta kombinacja S9 z testem AMES pozwala na bardziej kompleksową ocenę potencjału mutagennego poprzez naśladowanie zarówno bezpośrednich, jak i metabolicznie aktywowanych mechanizmów mutagennych.

2. 2.Testy mutacji (test aberracji chromosomalnej, test mikronukleusa i inne testy in vitro)

Oprócz testu AMES, testy mutacji są powszechnie stosowane do oceny potencjału genotoksycznego chemikaliów. Testy te są bardziej wszechstronne w ocenie szeregu uszkodzeń genetycznych, w tym mutacji chromosomalnych, mutacji genów i tworzenia się mikrojącle. Indukowana wątroba szczura S9 jest wykorzystywana w testach mutacji z następujących powodów:

Test mikroukuleusa (OECD 487)

Ten test wykrywa powstawanie mikrojąkleów w komórkach, które są małymi, zewnętrznymi ciałami zawierającymi fragmenty chromosomów lub całych chromosomów, które nie zostały włączone do jądra podczas podziału komórek. . Test mikroukuleusamoże wykrywać efekty clastogenne (chromosom - łamanie) i aneguniczne (wpływające na liczbę chromosomów). Indukowana szczuro wątroby S9 jest tutaj stosowana do aktywowania substancji testowej metabolicznie, ponieważ niektóre chemikalia powodują uszkodzenie chromosomalne tylko po ich metabolizowaniu przez enzymy wątroby. Frakcja S9 zwiększa czułość testu poprzez symulację aktywacji metabolicznej, która może wystąpić in vivo.

Test aberracji chromosomalnej (OECD 473)

Ten test ocenia, czy substancja może powodować uszkodzenie strukturalne chromosomów poprzez indukowanie przerwy, usuwania, translokacji lub innych rodzajów aberracji. Podobnie jak test mikronukleusowy,Test aberracji chromosomalnejmożna zastosować z aktywacją metaboliczną lub bez. Indukowana szczura wątroba S9 jest dodawana do systemu testowego, aby naśladować procesy metaboliczne w wątrobie, umożliwiając ocenę substancji, które mogą nie powodować uszkodzenia chromosomalnego w ich pierwotnej postaci, ale mogą to zrobić po metabolizmie wątroby.

Tabela 1. Rozważania porównawcze testów mutacji

Test HPRT/HGPRT (OECD 476)

WTest HPRT/HGPRT, Hodowle chińskiego chomika (CHO lub V79) lub ludzkich komórek limfoblastoidowych (TK6) są narażone na testową chemikalia w obecności indukowanej mieszanki metabolicznej wątroby szczura, która dostarcza enzymy CYP450 wymagane do przekształcania pro -mutagenów w gatunki reaktywne DNA. Po krótkim leczeniu i siedmiodniowym okresie ekspresji komórki są kwestionowane 6 -tioguaniną; Tylko klony zawierające mutacje utraty i funkcji w genie fosforybozylotransferazy hipoksantynowej przeżywają. Porównując liczbę zmutowanej kolonii z ogólną żywotnością, naukowcy określają częstotliwość mutacji, która, jeśli jest powtarzalnie podwyższona zarówno w stosunku do kontroli jednoczesnych, jak i historycznych, wskazuje na potencjał genotoksyczny.

Testy TK (OECD 490 i OECD 476)

.Tek TK Zastosuje komórki chłoniaka myszy L5178 (OECD 490) lub komórki CHO (OECD 476) zaprojektowany heterozygotyczny w locus kinazy tymidyny. Po ekspozycji chemicznej ± S9 mieszanki komórki odzyskują i są wysiane w pożywce zawierającej trifluorotymidynę, która zabija komórki Tk -nafiliczne. Przeżyły mutanty TK⁻ tworzą kolonie w ciągu 10–14 dni, z mutanami małymi kolonią często odzwierciedlającymi zdarzenia chromosomalne i mutanty dużych kolonii odzwierciedlające mutacje punktowe. Podobnie jak w teście HPRT/HGPRT, rygorystyczne kontrole cytotoksyczności i pozytywne odniesienia mutagenowe zapewniają niezawodne zwiększenie częstotliwości mutacji odzwierciedlają ryzyko genotoksyczne związku.

4. 4. Ocena ryzyka raka

W badaniach S9 indukowanej wątroby szczura jest również stosowane w badaniach mających na celu ocenę raka - Powodujące potencjał substancji. Symulując procesy metaboliczne występujące w ludzkiej wątrobie, frakcja S9 może pomóc zidentyfikować związki, które mogą prowadzić do tworzenia reaktywnych metabolitów zdolnych do wiązania z DNA i powodowania mutacji, które mogą prowadzić do raka.

Ulepszony test AMES z indukowaną wątrobą chomika S9

Zgodnie z najnowszymi wytycznymi wydanymi przez Europejską Agencję Leków (EMA) tradycyjny test AMES może nie być wystarczająco wrażliwy, aby wykryć potencjał mutagenny niektórych zanieczyszczeń N - nitrozaminy, zwłaszcza N - N - Netrosodimetyloaminę (NDMA). Dlatego test Emphanced AMES, opracowany przez National Center for Toxicological Research (NCTR), podział amerykańskiej Agencji ds. Żywności i Leków (FDA), został zalecany jako bardziej wiarygodna alternatywa. Wprowadzony test AMES wprowadził dodanie indukowanej wątroby chomika S9, która wykonywała w zawierającej 30% wątroby szczura S9 i 30% wątroby S9 chomika. Supernatanty desmosomalne szczura i chomika (S9S) należy przygotować z wątroby gryzoni traktowanych enzymem cytochromu P450 - indukującym substancje. Stosując indukowaną wątrobę chomika S9, ten ulepszony test lepiej symuluje ludzki metabolizm i zwiększa wiarygodność wyników.

Wniosek

Indukowana szczura wątroba S9 służy jako krytyczne narzędzie w testach genotoksyczności, pomagając badaczom i agencjom regulacyjnym w ocenie potencjału mutagennego i rakotwórczego chemikaliów. Zapewniając system aktywacji metabolicznej, zwiększa zdolność testów takich jak test AMES, testy mutacji i badania aktywności CYP450 do wykrywania substancji wymagających aktywacji metabolicznej, aby stać się genotoksyczne. Jego zastosowania są niezbędne do zapewnienia bezpieczeństwa nowych leków, chemikaliów i produktów konsumenckich. Z jego rolą w symulacji metabolizmu ludzkiej wątroby, indukowana frakcja S9 w wątrobie szczura jest niezbędną częścią współczesnej toksykologii i regulacyjnych ocen bezpieczeństwa.