Pierwotne hepatocyty: kluczowe narzędzie do rozwoju nie -

Pierwotne hepatocyty: kluczowe narzędzie do rozwoju nie -

Wątroba, jako główny narząd do narażenia na leki, odgrywa kluczową rolę w metabolizmie leku i procesach toksyczności. Pierwotne hepatocyty mają pełne spektrum właściwości komórkowych i fizjologiczne poziomy enzymów i kofaktorów, w tym enzymy związane błony - związane, takie jak cytochrom P450 (mieszana oksydaza funkcyjna w gładkim retikulum endoplazmatycznym) i esteraz cytosolicznych, wiążących wszystkie ścieżki metaboliczne znalezione. Z tego powodu pierwotne hepatocyty są powszechnie uważane za złoty standard konstruowania modeli wątroby in vitro i są faworyzowane przez badaczy w zakresie interakcji leku, metabolizmu leku i badań toksyczności. Ten artykuł zawiera przegląd modeli hodowli 2D i 3D opartych na pierwotnych hepatocytach i ich zastosowaniach w opracowywaniu leków.

Słowa kluczowe: pierwotne hepatocyty, uprawa 2D, uprawa 3D, Organoids, CO - Culture.

1. 1. Izolacja pierwotnych hepatocytów

Izolacja pierwotnych hepatocytów jest kluczowym krokiem w ustanowieniu modeli wątroby in vitro, przy czym najczęściej stosowana jest metoda perfuzji kolagenazy z dwóch. U mniejszych zwierząt perfuzja wątroby można wykonywać za pomocą żyły wrotnej lub dolnej żyły głównej, podczas gdy większe zwierzęta zwykle wymagają perfuzji przez płaty lub segmenty wątroby. Kilka kluczowych czynników wpływa na udaną izolację hepatocytów: po pierwsze, kolagenaza powinna być nie - cytotoksyczna. Po drugie, czas trawienia jest kluczowy -Zarówno pod - trawienie, jak i na pokłady może zagrozić wydajności i żywotności hepatocytów. Po trzecie, stan wątroby musi być optymalny, ponieważ hepatocyty są bardzo wrażliwe na uszkodzenie niedokrwienne. Wątroba stosowana do przygotowania hepatocytów powinna być szybko chłodzona w celu zmniejszenia szybkości metabolicznej i zapobiegania niedotlenieniem metabolicznym, a następnie niedokrwienia.

Standardy pierwotnych hepatocytów stosowane w badaniach leków są następujące:

1. 2. Pierwotna hodowla hepatocytów 2D

Model zawiesiny hepatocytów

Zawiera kompletne enzymy metabolizujące i kofaktorów, co czyni go odpowiednim do badania różnych szlaków klirensu metabolicznego. Jednak żywotność hepatocytów zawiesiny i aktywność enzymów metabolizujących leki stopniowo zmniejszają się wraz ze wzrostem czasu inkubacji in vitro, ograniczając czas inkubacji do maksymalnie 4 godziny. Model ten jest zwykle stosowany do oszacowania klirensu leków o umiarkowanym do wysokiego wskaźnika prześwitu. Gdy wskaźnik klirensu jest mniejszy niż 20%, nie można ustalić dokładnych wartości klirensu. Tradycyjne modele hepatocytów zawiesiny - Oparte na metabolizmie in vitro są niewystarczające do generowania wykrywalnych reakcji metabolicznych dla powolnych - metabolizujących związków, ograniczając w ten sposób ich zdolność do przewidywania szybkości prześwitu i produktów metabolicznych tych związków. Metodę przekaźnika hepatocytów zawiesiny (ryc. 1) można zastosować do wydłużenia czasu inkubacji do 20 godzin lub nawet dłużej.

Aplikacja:Badania aktywności enzymatycznej i stabilności metabolicznej dla leków małych cząsteczek.

Ryc. 1. Proces przesyłania przekaźnika przekaźnika hepatocytów zawiesiny

Źródło: Dress Metab, 2012,40 (9): 1860–1865

Model płyty hepatocytów

Pierwotne hepatocyty są hodowane w systemie 2D na płytkach hodowlanych kolagenu. Hepatocyty wykazują morfologię nabłonka, z wystającymi jąderkami, często występującymi w postaci binukletacji. Wady pojedynczej hepatocytów hodowli monowarstwowej obejmują: 1. Zmiana polarności i funkcji komórkowej 2. Brak innych odpowiednich typów komórek (tj. Komórki miąższowe), które są wymagane do normalnej funkcji. Niemożność dostarczenia wystarczającej ilości składników odżywczych i czynników parakrynowych do wsparcia hepatocytów w wykonywaniu ich funkcji (takich jak biosynteza białka w kwasie żółciowej i białko w surowicy).

Zastosowania:

1). Ocena interakcji dotyczących narkotyków -Obejmuje to indukcję enzymu, hamowanie enzymu i badania transporterowe. Po pierwsze, gdy lek działa jako induktor, może prowadzić do zwiększonej ekspresji enzymów i transporterów metabolizujących leki. Silne induktory mogą jednocześnie regulować wiele genów, takich jak indukcja fenobarbitalna CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT i kilku białek transportowych, takich jak MRP2. Po drugie, istnieją gatunki - specyficzne różnice w tym, jak hepatocyty reagują na induktory. Na przykład ryfampicyna jest skutecznym induktorem hepatocytów ludzkich i królika, ale nie ma wpływu indukcyjnego na hepatocyty szczura. Wreszcie, nieoptymalna gęstość poszyjania płyty hepatocytów może prowadzić do zmniejszenia podstawowej ekspresji p450 i sztucznie zwiększonej odpowiedzi indukcyjnej. Jak pokazano na rycinie 3, hepatocyty przy niższej gęstości poszycia wykazują niższą podstawową aktywność CYP1A2, CYP2B6 i CYP3A4, ale silniejsze odpowiedzi indukcyjne. Dlatego zdrowe hepatocyty przy odpowiedniej gęstości poszycia są niezbędne do uzyskania danych istotnych fizjologicznie.

Rycina 2. Zależność między gęstością poszyjania kriokonserwowanych ludzkich hepatocytów a indukcją enzymu

Źródło: Current Drug Discovery Technologies, 2010, 7: 188 - 198

2). Ocena hepatotoksyczności: Obserwowanie zmian morfologicznych pod mikroskopem świetlnym, takich jak morfologia komórki, agregacja kropel i lipidów oraz przyłączenie/odłączenie komórek. Wykrywanie martwicy hepatocytów (na co wskazuje aminotransferaza asparaginianowa, dehydrogenazy mleczanowej i aminotransferazy alaniny) i apoptozy (fragmentacja DNA). W przypadku cytotoksyczności za pośrednictwem cytokiny - pojedyncze hodowle monowarstwowe hepatocytów nie mogą przewidzieć toksycznych odpowiedzi z powodu regulacji przez substancje uwalniane z sąsiednich nie -miąższowych komórek, takich jak komórki Kupffera, komórki gwiaździste i sinusoidalne komórki śródbłonka.

3). „Metoda przekaźnika” do badania powolnego metabolizującego klirensu i jej metabolitów: Aktywność enzymów metabolizujących leki - w płytych hepatocytów zaczyna zmniejszać się po 24 godzinach poszycia. Po inkubacji płytkowych hepatocytów z pożywką wolną w surowicy zawierającej mieszanka interesujące przez 24 godziny, pożywka jest zbierana i mieszana, a następnie przenoszona do nowych płyty hepatocytów do dalszych badań (ryc. 3).

Rycina 3. Proces przesyłania metody przekaźnika hepatocytów Hepatocytów

Źródło: Metabolizm Letters, 2016, 10: 3 - 15

3). Oceń pobieranie komórkowe, endocytozę, ucieczkę endosomalną i wyciszanie na docelowym genu hepatocytów - Ukierunkowane małe leki kwasu nukleinowego.

Model uprawy kanapkowej

In vitro hepatocyty mogą być hodowane między dwiema warstwami kolagenu lub matrigel, aby rekonstruować struktury in vivo, zwane uprawą kanapkową. Hepatocyty hodowane między dwiema warstwami żelu - kolagen (struktura kanapki) mogą poprawić morfologię i żywotność komórek oraz utrzymywać ich funkcjonalność przez dłuższy czas. Ponadto hepatocyty w hodowli kanapkowej mogą przywrócić polaryzację, umożliwiając prawidłową lokalizację transporterów podstawno -bocznych i kanałowych, a także tworzenie funkcjonalnych sieci przewodów żółciowych (ryc. 4).

Rycina 4. Spolaryzowana ekspresja transporterów w ludzkim modelu kanapki hepatocytów

Źródło: Current Drug Discovery Technologies, 2010, 7, 188 - 198

Zastosowania:

1. 1). Oszacowanie wydalania żółciowych związków.
2. 2). Ocena rozkładu wątrobowego i żółciowego związków endogennych i egzogennych i metabolitów.
3. 3). Oszacowanie klirensu za pośrednictwem metabolizmu i transporterów oraz konstruowanie modeli farmakokinetycznych opartych na fizjologii.
4. 4). Badanie hepatotoksyczności i dostarczanie mechanizmów klinicznego leku - indukowane uszkodzeniem wątroby. Dane są zintegrowane z modelem farmakologii systemów w celu przewidywania potencjalnego leku - indukowanym uszkodzeniem wątroby u ludzi.
5.  
   1. 3. Pierwotna hodowlana hepatocytów 3D

6. W systemach hodowli 3D hepatocyty hodowane są w matrycy trójwymiarowej, która lepiej naśladuje architekturę wątroby in vivo w porównaniu z kulturami monowarstwowymi 2D. Systemy te promują interakcje komórkowe i komórkowe - macierzy, które mogą przywrócić więcej funkcji fizjologicznych wątroby, w tym metabolizm leku, wydzielanie białka i tworzenie żółci. Pierwotne kultury 3D hepatocytów mogą być stosowane do badania funkcji wątroby - Specyficzne funkcje w bardziej in vivo - podobne do środowiska, oferowanie zalet testowania leków, oceny toksyczności i modelowania chorób.

   Model sferoidowy

Dzięki takim technikom, jak ultra - niskiej hodowli przyczepności, wisząca hodowla kropli i hodowla komórek magnetycznych (ryc. 5), pierwotne hepatocyty mogą agregować w sferoidalne agregaty o średnicy do 150 - 175 µm bez oparcia się na matrycach zewnętrznych. Jedną z zalet hodowli sferoidowej jest to, że każdy sferoid wymaga tylko 1330 - 2000 komórek, co znacznie zmniejszając liczbę komórek w porównaniu z innymi technikami hodowli 3D. Ostatnie badania wykazały, że pierwotne kultury sferoidowe hepatocytów mogą utrzymywać się do 5 tygodni, przy czym aktywność enzymu CYP pozostaje prawie niezmieniona między dniem 8 a 35. Analiza proteomiczna ujawniła, że ​​w porównaniu z hodowlą kanapkową enzymy odpowiedzialne za wchłanianie leków, dystrybucję, metabolizm i wydalanie są lepiej zachowane przez 14 dni w kulturze sferoidalnej. Jednak wątroba jest znacznie bardziej złożona niż agregat komórki. Bazolateralna strona hepatocytów oddziałuje z krwią, podczas gdy żółć wypływa ze strony wierzchołkowej, która jest kluczową cechą złożonej struktury płata wątroby, a nie można tego jeszcze powtórzyć w modelu sferoidalnym.

Zastosowania:

1. 1). Badanie powolnego metabolizującego klirensu związku i jego metabolitów.
2. 2). Badania hepatotoksyczności.
3. 3). Ocena wychwytu komórkowego, endocytozy, ucieczki endosomalnej i wyciszania na docelowe geny hepatocytów - Ukierunkowane małe leki kwasu nukleinowego.

Rycina 5. Metoda hodowli sferoidalnej

Model organoidów wątroby

Definicja konsensusu organoidów to: struktury 3D pochodzące z komórek macierzystych, komórek progenitorowych lub zróżnicowanych komórek, zdolne do odtworzenia niektórych funkcji i struktur natywnej tkanki in vitro, skutecznie naśladując interakcje mikrośrodowiska in vivo i komórki. Organooidy wątroby zostały zidentyfikowane jako najbardziej zaawansowany model badań biologii ludzkiej wątroby.

Źródła komórek do konstrukcji organoidalnej wątroby:

① Pluripotentne komórki macierzyste (PSC):

Embrionalne komórki macierzyste (ESC) i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (IPSC) mają wysoką pluripotencję, plastyczność i nieograniczoną zdolność proliferacyjną. Pod wpływem specyficznych czynników sygnalizacyjnych różnicują się na hepatocyt - podobne komórki z aktywnością i funkcją. Jednak organoidy wątroby pochodzące z PSC mogą ulegać zmianom epigenetycznym i genetycznym, wykazując zmiany aneuploidii chromosomalnej podczas amplifikacji.

Zastosowania:

1. 1). Genetyczne modele chorób wątroby
2. 2). Zakaźne modele chorób wątroby
3. 3). Testy cytotoksyczności leku

② Komórki tkanki wątroby - obejmują one cholangiocyty i hepatocyty. Dojrzałe hepatocyty zachowują potencjał komórek macierzystych i zdolność proliferacyjną w określonych środowiskach. W porównaniu z organoidami pochodnymi PSC, organoidy pochodzące z tkanki pierwotnej są bardziej dojrzałe, z bardziej stabilnymi genomami i zachowują stabilność fenotypową i genetyczną podczas długiej hodowli in vitro. Jednak długa - terminowa zdolność proliferacyjna dojrzałych ludzkich hepatocytów jest ograniczona w porównaniu z płodowymi ludzkimi hepatocytami lub dorosłymi pierwotnymi hepatocytami myszy. Hodowanie dorosłych hepatocytów zachorowników pozostaje trudne.

Metoda hodowli (ryc. 6): Tkanka wątroby jest trawiona w pojedynczych komórkach, a mieszaninę matrigel i komórek jest zaszczepiona w płytce 24 - Inkubuj w inkubatorze hodowli komórkowej (37 ° C) przez 15 minut. Po zestaleniu dodaj określone medium hodowlane. Przejście po około 14 dniach. Wymień oryginalne medium na medium różnicujące po 7 - 10 dniach.

Zastosowania:

1. 1). Modele hepatotoksyczności
2. 2). Badania zaburzeń metabolizmu in vitro
3. 3). Nieprzestrzenna choroba wątroby tłuszczowej
4. 4). Rozwój leków dla łagodnych i złośliwych chorób wątroby

Rycina 6. Proces hodowli i przejścia tkanki - pochodnych organoidów wątroby

Źródło: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

Porównanie kultury sferoidalnej i kultury organoidalnej

4. Pierwotny model hepatocytów CO -

1. 1. 2D Pierwotny model hepatocytów CO -
      

      W 2D pierwotnym modelu hepatocytów CO - hodowl dwa lub więcej różnych typów komórek są mieszane i hodowane w środowisku dwóch - Kluczową cechą tego modelu jest bezpośrednia interakcja między różnymi typami komórek, interakcja między komórkami a matrycą pozakomórkową lub pośrednią transmisję sygnału za pośrednictwem cytokin i komunikacji chemicznej. Pierwotne funkcje hepatocytów, takie jak produkcja albuminy i zdolność metabolizmu leku, można utrzymywać przez okres do trzech tygodni.

      Zastosowania:

      1. 1). Pierwotne hepatocyty hodowane z fibroblastami: Ten model służy do badania szybkości klirensu powolnych związków metabolizujących i ich metabolitów.
      2. 2). Pierwotne hepatocyty CO - hodowane z nie miąższowymi komórkami wątroby (np. Komórki gwiaźniowe, sinusoidalne komórki śródbłonka): Ten model jest przydatny do badań uszkodzenia wątroby indukowanego przez leku (DILI), ponieważ pomaga zbadać rolę cytokin, chemokin i czynników wzrostu w modulowaniu reakcji adaptacyjnych pod wątrobą.
      3. 3). Pierwotne hepatocyty hodowane za pomocą komórek T: Ten model służy do wykrywania metabolizmu leku wątroby - Specyficzne odpowiedzi komórek T.
      4. 4). IPHASE's Hepatomax ™CO - System hodowli: IPHase opracował system hodowli CO -™. Dzięki hodowli ludzkich pierwotnych hepatocytów komórkami zrębowymi możliwe jest utrzymanie dobrej aktywności enzymu metabolizującego leku w ludzkich hepatocytach przez okres do 3 tygodni. Ten system jest odpowiedni do badania powolnego - metabolizującego wskaźnika klirensu i ich metabolitów.

      Ten model hodowli CO - zapewnia bardziej fizjologicznie istotną platformę do oceny metabolizmu leków, toksyczności i procesów chorobowych związanych z wątrobą, oferując wgląd w to, w jaki sposób różne typy komórek przyczyniają się do funkcji i choroby wątroby.
      
      

      3D Pierwotny model hepatocytów CO - hodowl

      Direct 3d Co - Kultura: Ten model obejmuje mieszanie dwóch lub więcej różnych rodzajów komórek wątroby (np. Pierwotne hepatocyty, sinusoidalne komórki śródbłonka, wątrobowe komórki gwiaździste, komórki Kupffera) w celu utworzenia samozatrudnionych sferoidów lub hodowli ich w środowisku 3D konstruowanym z materiałami takimi jak kolagen, fibryna, alginiana lub hydrogele. Bezpośrednia hodowla 3D CO - umożliwia ścisłą interakcję między różnymi komórkami wątroby poprzez mechanizmy takie jak komórka - adhezja komórek, sygnalizacja parakrynowa poprzez rozpuszczalne cytokiny i adhezję macierzy zewnątrzkomórkowej, umożliwiając komunikację między hepatocytami.

      Zastosowania:

      1. 1). Model zwłóknienia wątroby: stosowany do badania mechanizmów i postępu zwłóknienia wątroby.
      2. 2). Model uszkodzenia wątroby indukowanego przez lek (DILI): pomaga symulować i oceniać uszkodzenie wątroby spowodowane przez leki.
      3. 3). Interakcje leków, metabolizm leku i indukcja enzymu: ocenia, w jaki sposób różne leki oddziałują, w jaki sposób są metabolizowane i jak indukują enzymy wątroby.

      Pośrednia 3D CO - Kultura: Ta metoda wykorzystuje fizyczny system separacji (np. Transwell lub inne materiały) do hodowli dwa lub więcej rodzajów komórek (takich jak pierwotne hepatocyty z komórkami NIH/3T3 lub sinusoidalne komórki śródbłonka) w środowisku 3D, w którym zapobiega kontaktowi komórki bezpośredniej komórki. Komunikacja między komórkami występuje za pomocą rozpuszczalnych cytokin.

      Zastosowania:
      Używany do badania komunikacji niekontaktowej między komórkami wątroby w organizmie.

      
      Podsumowując, iPhase, jako lider badań biologicznych in vitro, zapewnia kompleksowe rozwiązania do badań narkotykowych nie - Od izolacji i hodowli pierwotnych hepatocytów od różnych gatunków po rozwój produktów wspierających, takich jak pożywki hodowlane do określonych zastosowań lub płytki kolagenowe wielofunkcyjne, iPhaza jest poświęcona oferowaniu najlepszych narzędzi badawczych in vitro do odkrywania i rozwoju leków. Jesteśmy zaufanym partnerem dla klientów w branży farmaceutycznej, zobowiązani do zapewnienia ograniczenia - Edge Solutions do badań nie -