Hepatócitos primários: uma ferramenta crucial para o avanço da pesquisa de medicamentos in vitro não clínica

Hepatócitos primários: uma ferramenta crucial para o avanço da pesquisa de medicamentos in vitro não clínica

O fígado, como o órgão principal da exposição a medicamentos, desempenha um papel crucial no metabolismo de drogas e nos processos de toxicidade. Os hepatócitos primários possuem o espectro completo das características celulares e os níveis fisiológicos de enzimas e cofatores, incluindo enzimas ligadas à membrana, como o citocromo p450 (uma misto - função oxidase no reticulador endoplasmático liso) e citosólicos esterases. Por esse motivo, os hepatócitos primários são amplamente considerados o padrão -ouro para a construção de modelos hepáticos in vitro e são favorecidos por pesquisadores em interação medicamentosa, metabolismo de medicamentos e estudos de toxicidade. Este artigo fornece uma visão geral dos modelos de cultura 2D e 3D baseados em hepatócitos primários e suas aplicações no desenvolvimento de medicamentos.

Palavras -chave: hepatócitos primários, cultivo 2D, cultivo 3D, organoides, co - Culture.

1. 1. Isolamento de hepatócitos primários

O isolamento dos hepatócitos primários é uma etapa crítica para estabelecer modelos hepáticos in vitro, com o método de perfusão de dois etapa de colagenase sendo o mais comumente usado. Em animais menores, a perfusão hepática pode ser realizada através da veia porta ou da veia cava inferior, enquanto animais maiores geralmente requerem perfusão através de lóbulos ou segmentos do fígado. Vários fatores -chave influenciam o isolamento bem -sucedido dos hepatócitos: Primeiro, a colagenase deve ser não citotóxica. Segundo, o momento da digestão é crucial -Tanto a Digestão quanto a Digestão Over - podem comprometer o rendimento e a viabilidade dos hepatócitos. Terceiro, a condição hepática deve ser ideal, pois os hepatócitos são altamente sensíveis a danos isquêmicos. O fígado usado para a preparação dos hepatócitos deve ser rapidamente resfriado para reduzir as taxas metabólicas e prevenir a hipóxia metabólica e a isquemia subsequente.

Os padrões de hepatócitos primários usados ​​na pesquisa de drogas são os seguintes:

1. 2. Cultura 2D de hepatócitos primários

O modelo de hepatócitos suspensos

Ele contém medicamentos completos - enzimas e cofatores de metabolização, tornando -o adequado para estudar várias vias de depuração metabólica. No entanto, a viabilidade dos hepatócitos suspensos e a atividade das enzimas de medicamento - metabolização diminuem gradualmente à medida que o tempo de incubação in vitro aumenta, limitando o tempo de incubação a um máximo de 4 horas. Este modelo é normalmente usado para estimar a depuração de medicamentos com taxas de folga moderada a alta. Quando a taxa de liberação é inferior a 20%, os valores precisos de folga não podem ser determinados. Os modelos tradicionais de hepatócitos de suspensão - baseados no metabolismo in vitro são insuficientes para gerar reações metabólicas detectáveis ​​para compostos lentos - metabolizar, limitando assim sua capacidade de prever as taxas de liberação e produtos metabólicos desses compostos. Um método de relé de hepatócitos de suspensão (Figura 1) pode ser usado para estender o tempo de incubação para 20 horas ou até mais.

Aplicativo:Estudos de atividade enzimática e estabilidade metabólica para drogas de pequenas moléculas.

Figura 1. Processo de transferência de retransmissão de hepatócitos de suspensão

Fonte: Drug Metab Dispos, 2012,40 (9): 1860-1865

O modelo de hepatócitos platáveis

Os hepatócitos primários são cultivados em um sistema 2D em placas de cultura de colágeno - Os hepatócitos exibem uma morfologia epitelial, com núcleos salientes, geralmente apresentando -se em uma forma binucleada. As desvantagens da cultura de monocamada de hepatócitos únicos incluem: 1. Alteração da polaridade e função celular.2. Falta de outros tipos de células relevantes (isto é, células não - parenquimatosas) necessárias para a função normal.3. Incapacidade de fornecer nutrientes e fatores parácrinos suficientes para apoiar os hepatócitos na execução de suas funções (como ácido biliar e biossíntese de proteínas séricas).

Aplicações:

1). Avaliação das interações medicamentosas -Isso inclui indução enzimática, inibição enzimática e estudos de transportadores. Em primeiro lugar, quando um medicamento atua como indutor, ele pode levar ao aumento da expressão de enzimas e transportadores de metabolização do medicamento. Indutores fortes podem regulamentar os genes múltiplos simultaneamente, como a indução fenobarbital de CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT e várias proteínas de transporte como MRP2. Em segundo lugar, existem espécies - diferenças específicas na maneira como os hepatócitos respondem aos indutores. Por exemplo, a rifampicina é um indutor eficaz para os hepatócitos humanos e de coelho, mas não tem efeito de indução nos hepatócitos de ratos. Finalmente, a densidade subótima de plaqueamento de hepatócitos platáveis ​​pode levar a uma expressão basal reduzida de P450s e respostas de indução artificialmente aumentadas. Como mostrado na Figura 3, os hepatócitos em densidades de revestimento mais baixos mostram menor atividade basal de CYP1A2, CYP2B6 e CYP3A4, mas respostas de indução mais fortes. Portanto, hepatócitos saudáveis ​​em uma densidade de revestimento apropriada são necessários para obter dados fisiologicamente relevantes.

Figura 2. Relação entre a densidade de plaqueação de hepatócitos humanos criopreservados e indução de enzima

Fonte: Current Drug Discovery Technologies, 2010, 7: 188 - 198 198

2). Avaliação da hepatotoxicidade: Observar alterações morfológicas sob um microscópio leve, como morfologia celular, agregação de gotículas de vacúolo e lipídios e conexão/descolamento celular. Detecção de necrose de hepatócitos (conforme indicado pela aspartato aminotransferase, lactato desidrogenase e alanina aminotransferase) e apoptose (fragmentação do DNA). Para citocinas - citotoxicidade mediada, as culturas de monocamadas únicas de hepatócitos não podem prever respostas tóxicas devido à regulação por substâncias liberadas das células não parenquimais vizinhas, como células Kupffer, células estreladas e células endoteliais sinusoidais.

3). "Método de relé" para estudo de liberação de composto de metabolização lenta e seus metabólitos: A atividade das enzimas de medicamento - metabolização em hepatócitos platáveis ​​começa a diminuir após 24 horas de revestimento. Após incubar os hepatócitos platáveis ​​com o soro - meio livre contendo o composto de interesse por 24 horas, o meio é coletado e misturado e depois transferido para novos hepatócitos platáveis ​​para estudos posteriores (Figura 3).

Figura 3. Processo de transferência de retransmissão de hepatócitos platáveis

Fonte: Letters de metabolismo de drogas, 2016, 10: 3 - 15

3). Avalie a captação celular, endocitose, fuga endossômica e efeitos de silenciamento no gene alvo de hepatócitos - pequenos medicamentos de ácido nucleico direcionado.

Modelo de cultivo de sanduíche

In vitro, os hepatócitos podem ser cultivados entre duas camadas de colágeno ou matrigel para reconstruir estruturas in vivo, conhecidas como cultivo de sanduíche. Os hepatócitos cultivados entre duas camadas de gel - colágeno (estrutura do sanduíche) podem melhorar a morfologia e a viabilidade das células e manter sua funcionalidade por um período mais longo. Além disso, os hepatócitos na cultura do sanduíche podem restaurar a polaridade, permitindo a localização adequada de transportadores basolaterais e canaliculares, bem como a formação de redes de ductos biliares funcionais (Figura 4).

Figura 4. Expressão polarizada de transportadores no modelo de sanduíche de hepatócitos humanos

Fonte: Current Drug Discovery Technologies, 2010, 7, 188 - 198 198

Aplicações:

1. 1). Estimativa de excreção biliar de compostos.
2. 2). Avaliando a distribuição hepática e biliar de compostos e metabólitos endógenos e exógenos.
3. 3). Estimativa de liberação mediada pelo metabolismo e transportadores e construção de modelos farmacocinéticos baseados em fisiologia -
4. 4). Estudar hepatotoxicidade e fornecer mecanismos para medicamentos clínicos - lesão hepática induzida. Os dados são integrados aos modelos de farmacologia de sistemas para prever a potencial lesão hepática induzida por medicamentos em humanos.
5.  
   1. 3. Cultura 3D de hepatócitos primários

6. Nos sistemas de cultura 3D, os hepatócitos são cultivados em uma matriz tridimensional, que imita melhor a arquitetura hepática in vivo em comparação com as culturas de monocamada 2D. Esses sistemas promovem as interações celular - célula e célula - matriz, que podem restaurar mais funções fisiológicas do fígado, incluindo metabolismo de drogas, secreção de proteínas e formação biliar. As culturas primárias de hepatócitos 3D podem ser usadas para estudar funções específicas em um ambiente mais in vivo, oferecendo vantagens para testes de drogas, avaliação de toxicidade e modelagem de doenças.

   Modelo esferóide

Através de técnicas como a cultura de apego ultra - baixa, a cultura de queda pendurada e a cultura de células magnéticas (Figura 5), ​​os hepatócitos primários podem se agregar em agregados esferoidais com um diâmetro de até 150 - 175 µm sem depender de matrizes externas. Uma vantagem da cultura esferóide é que cada esferóide requer apenas 1.330 - 2.000 células, reduzindo significativamente o número de células em comparação com outras técnicas de cultura 3D. Recent studies have shown that primary hepatocyte spheroid cultures can sustain for up to 5 weeks, with CYP enzyme activity remaining almost unchanged between day 8 and day 35. Proteomics analysis revealed that, compared to sandwich culture, enzymes responsible for drug absorption, distribution, metabolism, and excretion are better preserved for 14 days in spheroid culture. No entanto, o fígado é muito mais complexo que um agregado celular. O lado basolateral dos hepatócitos interage com o sangue, enquanto a bile flui para fora do lado apical, que é uma característica essencial da estrutura complexa do lóbulo do fígado, e isso ainda não pode ser replicado no modelo esferóide.

Aplicações:

1. 1). Estudo da liberação de composto de metabolização lenta e seus metabólitos.
2. 2). Pesquisa de hepatotoxicidade.
3. 3). Avaliação da captação celular, endocitose, fuga endossômica e efeitos de silenciamento nos genes alvo de hepatócitos - pequenos medicamentos de ácido nucleico direcionado.

Figura 5. Método de cultura esferóide

Modelo de organoides do fígado

A definição de consenso de organoides é: estruturas 3D derivadas de células -tronco, células progenitoras ou células diferenciadas, capazes de reproduzir certas funções e estruturas do tecido nativo in vitro, imitando efetivamente o microambiente in vivo e as interações celulares. Os organoides hepáticos foram identificados como o modelo mais avançado para a pesquisa em biologia hepática humana.

Fontes celulares para construção orgânica do fígado:

① células -tronco pluripotentes (PSCs):

As células -tronco embrionárias (ESCs) e as células -tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) possuem alta pluripotência, plasticidade e capacidade proliferativa ilimitada. Sob a influência de fatores de sinalização específicos, eles se diferenciam em células de hepatócitos - como atividade e função. No entanto, os organoides hepáticos derivados de PSCs podem sofrer alterações epigenéticas e genéticas, exibindo alterações de aneuploidia cromossômica durante a amplificação.

Aplicações:

1. 1). Modelos genéticos de doença hepática
2. 2). Modelos de doenças hepáticas infecciosas
3. 3). Teste de citotoxicidade de drogas

② Tecido hepático - células derivadas: incluem colangiócitos e hepatócitos. Os hepatócitos maduros retêm o potencial das células -tronco e a capacidade proliferativa em ambientes específicos. Comparados aos organoides derivados de PSC -, os organoides derivados do tecido primário são mais maduros, com genomas mais estáveis, e mantêm a estabilidade fenotípica e genética durante a cultura in vitro longa. No entanto, a capacidade proliferativa longa de termo de organoides de hepatócitos humanos maduros é limitada em comparação com hepatócitos humanos fetais ou hepatócitos primários de camundongos adultos. A cultura dos organoides adultos de hepatócitos permanece desafiadora.

Método de cultura (Figura 6): O tecido hepático é digerido em células únicas e uma mistura de matrigel e células é semeada em uma placa 24 - poço para formar estruturas em forma de cúpula - Incubar em uma incubadora de cultura de células (37 ° C) por 15 minutos. Após a solidificação, adicione meio de cultura específico. Passagem após aproximadamente 14 dias. Substitua o meio original pelo meio de diferenciação após 7 - 10 dias.

Aplicações:

1. 1). Modelos de hepatotoxicidade
2. 2). Estudos de transtorno do metabolismo in vitro
3. 3). Doença hepática gordurosa não alcoólica
4. 4). Desenvolvimento de medicamentos para doenças hepáticas benignas e malignas

Figura 6. Processo de cultura e passagem de tecido - Organóides do fígado derivado

Fonte: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

Comparação da cultura esferóide e da cultura organoide

4. Modelo de cultura de hepatócitos primários

1. 1. 2D Primary Hepatocyte Co - Culture Model
      

      No modelo de cultura de hepatócitos primários 2D, dois ou mais tipos de células diferentes são misturados e cultivados em um ambiente de duas dimensões. A principal característica desse modelo é a interação direta entre diferentes tipos de células, a interação entre células e a matriz extracelular ou a transmissão de sinal indireta por meio de citocinas e comunicações químicas. As funções primárias de hepatócitos, como produção de albumina e capacidade de metabolismo de drogas, podem ser mantidas por até três semanas.

      Aplicações:

      1. 1). Os hepatócitos primários são cultivados com fibroblastos: este modelo é usado para estudar a taxa de liberação de compostos lentos de metabolização e seus metabólitos.
      2. 2). Os hepatócitos primários são cultivados com células hepáticas não parenquimatosas (por exemplo, células estreladas, células endoteliais sinusoidais): esse modelo é útil para pesquisar medicamentos - lesões hepáticas induzidas (DILI), pois ajuda a investigar o papel de citocina, quimiocina e fatores de crescimento na modulação do LIVRO.
      3. 3). Os hepatócitos primários são cultivados com células T: este modelo é usado para detectar o metabolismo do medicamento hepático - Respostas específicas das células T.
      4. 4). Iphase's's Hepatomax ™Co - Sistema de cultura: a iphase desenvolveu um sistema de cultura com hepatócitos primários de diferentes espécies, conhecidas como hepatomax™. Ao cultivar hepatócitos primários humanos com células estromais, é possível manter um bom medicamento - metabolizar a atividade enzimática em hepatócitos humanos por até 3 semanas. Este sistema é adequado para estudar as taxas de liberação de compostas lentas - metabolização e seus metabólitos.

      Este modelo de cultura Co - fornece uma plataforma mais fisiologicamente relevante para avaliar os processos de doenças relacionadas ao metabolismo de medicamentos, toxicidade e fígado, oferecendo informações sobre como diferentes tipos de células contribuem para a função e a doença do fígado.
      
      

      3D Primary Hepatocyte Co - Culture Model

      Cultura 3D direta: Este modelo envolve a mistura de dois ou mais tipos diferentes de células hepáticas (por exemplo, hepatócitos primários, células endoteliais sinusoidais, células estreladas hepáticas, células de Kupffer) para formar esferóides auto -montados ou co -cultura -os em um ambiente 3D construídos com materiais como colágeno, fibrina, alginados, ou hidratá -los. A cultura 3D direta permite interação estreita entre diferentes células hepáticas através de mecanismos como a célula - a - adesão celular, a sinalização da parácrina por meio de citocinas solúveis e adesão da matriz extracelular, permitindo a comunicação entre hepatócitos.

      Aplicações:

      1. 1). Modelo de fibrose hepática: usado para estudar os mecanismos e a progressão da fibrose hepática.
      2. 2). Modelo de lesão hepática induzida por drogas - Induzida (DILI): ajuda a simular e avaliar os danos no fígado causados ​​por medicamentos.
      3. 3). Interações medicamentosas, metabolismo de medicamentos e indução de enzimas: avalia como os diferentes medicamentos interagem, como são metabolizados e como induzem enzimas hepáticas.

      Cultura 3D indireta: Este método usa um sistema de separação física (por exemplo, transwell ou outros materiais) para cultivar dois ou mais tipos de células (como hepatócitos primários com células NIH/3T3 ou células endoteliais sinusoidais) em um ambiente 3D, onde a célula direta - o contato celular é impedido. A comunicação entre as células ocorre através de citocinas solúveis.

      Aplicações:
      Usado para estudar a comunicação não - Contato entre células hepáticas no corpo.

      
      Em resumo, a Iphase, como líder em pesquisa biológica in vitro, fornece soluções abrangentes para testes de medicamentos não clínicos. Desde o isolamento e cultura de hepatócitos primários de várias espécies até o desenvolvimento de produtos de apoio, como meios de cultura para aplicações específicas ou placas de colágeno de múltiplas especificações - Somos um parceiro de confiança para clientes da indústria farmacêutica, comprometida em fornecer soluções de corte - Edge para pesquisa não clínica.