Fracția S9 a ficatului de șobolan indus: un sistem de activare metabolică pentru testele de genotoxicitate și mutație in vitro

Cuvinte cheie: OCDE 471, OCDE 473, OCDE 476, OCDE 487, test de mutație, genotoxicitate, toxicitate genetică, ficat de șobolan indus, test Ames, test Ames Mini, aberație cromozomială, micronucleus, test HPRT/HGPRT, test TK TK

Produs ifazat

Introducere

Ficat de șobolan indus S9este o componentă cheie în evaluareatoxicitate geneticăPotențial al substanțelor chimice, în special în toxicologia de reglementare. Este utilizat frecvent în combinație cu teste in vitro, cum ar fiTestul Ames şiTeste de mutație, pentru a evalua proprietățile mutagene ale compușilor. Prin furnizarea de sistem enzimatic bogat în citocromul P450 (CYP450), fracția de ficat de șobolan indusă joacă un rol crucial în simularea proceselor metabolice care apar în ficat, contribuind la determinarea dacă substanțele chimice pot provoca mutații genetice sau cancer.

Ficat de șobolan indus S9

Fracția ficatului S9 se referă la un post - supernatant mitocondrial obținut de la omogeniții ficatului de șobolan după o serie de etape de centrifugare. Termenul „indus” se referă la tratamentul șobolanilor cu compuși specifici care îmbunătățesc activitatea enzimelor hepatice, în special enzimele citocromului P450 (CYP450), care sunt responsabile pentru metabolismul unei game largi de xenobiotic.

Fracția de ficat de șobolan indusă conține o varietate de enzime care sunt implicate în metabolismul de fază I și faza II a substanțelor chimice. Aceasta include enzime precum monooxigenazele citocromului P450, care facilitează biotransformarea oxidativă a substraturilor, imitând astfel metabolismul hepatic uman.

Activitate CYP450 și activare metabolică

Familia enzimei citocrom P450 (CYP450) joacă un rol pivot în metabolismul unei mari varietăți de substanțe, inclusiv multe produse farmaceutice, substanțe chimice de mediu și cancerigeni. Fracția de ficat de șobolan indusă conține aceste enzime și este esențială pentru evaluarea substanțelor chimice care pot deveni genotoxice numai după activarea metabolică.

Mulți compuși sunt inițial non -toxici, dar pot deveni toxici după metabolismul în ficat. Acești pro - mutageni (care necesită activare metabolică pentru a deveni mutageni) și pro - carcinogeni (care necesită activare pentru a provoca cancer) pot fi detectate doar prin teste care includ un sistem de activare metabolică S9. Fără inducerea enzimelor metabolice precum CYP450, aceste substanțe pot părea inofensive în testele standard de genotoxicitate.

Prin adăugarea ficatului de șobolan indus la teste in vitro, cercetătorii pot evalua modul în care o substanță interacționează cu enzimele CYP450. Acest lucru este deosebit de important pentru produsele farmaceutice, deoarece metabolismul enzimelor CYP450 este un pas critic în farmacocinetica multor medicamente.

Aplicații ale ficatului de șobolan indus S9

1. 1. Testul Ames (OCDE 471)

Testul AMES, prezentat în ghidOCDE 471, este una dintre cele mai bine cunoscute și utilizate metode pentru evaluarea mutagenității. Ea implică expunerea tulpinilor de bacterii Salmonella la o substanță chimică de testare pentru a vedea dacă induce mutații care determină revenirea bacteriilor la o stare de histidină - independentă.

Pentru a simula procesul metabolic uman, ficatul de șobolan indus este adesea adăugat la sistemul de testare. Fracția S9 oferă enzimele necesare, inclusiv CYP450, care ar putea fi necesare pentru a metaboliza compusul într -o formă mai reactivă care ar putea provoca mutații în ADN -ul bacterian. Această combinație de S9 cu testul AMES permite o evaluare mai cuprinzătoare a potențialului mutagen prin imitarea atât a mecanismelor mutagenice activate direct, cât și a celor activate metabolic.

2. 2.Teste de mutație (test de aberație cromozomială, test de micronucleu și alte teste in vitro)

În plus față de testul AMES, testele de mutație sunt utilizate în mod obișnuit pentru a evalua potențialul genotoxic al substanțelor chimice. Aceste teste sunt mai cuprinzătoare în evaluarea unei serii de daune genetice, inclusiv mutații cromozomiale, mutații genice și formarea de micronuclee. Ficatul de șobolan indus este utilizat în testele de mutație din următoarele motive:

Test de micronucleus (OCDE 487)

Acest test detectează formarea de micronuclee în celule, care sunt corpuri mici, extranucleare, care conțin fragmente de cromozomi sau cromozomi întregi care nu au fost încorporați în nucleu în timpul divizării celulare. Test de micronucleuspoate detecta efectele clastogene (cromozomi - rupere) și aneugenică (afectând numărul cromozomului). Ficatul de șobolan indus este utilizat aici pentru a activa metabolic substanța de testare, deoarece unele substanțe chimice provoacă leziuni cromozomiale după ce au fost metabolizate de enzime hepatice. Fracția S9 îmbunătățește sensibilitatea testului prin simularea activării metabolice care poate apărea in vivo.

Test de aberație cromozomială (OCDE 473)

Acest test evaluează dacă o substanță poate provoca deteriorarea structurală a cromozomilor prin inducerea pauzelor, ștergerilor, translațiilor sau a altor tipuri de aberații. Ca testul micronucleului,Test de aberație cromozomialăpoate fi aplicat cu sau fără activare metabolică. Ficatul de șobolan indus S9 este adăugat la sistemul de testare pentru a imita procesele metabolice din ficat, permițând evaluarea substanțelor care ar putea să nu provoace daune cromozomiale în forma lor inițială, dar ar putea face acest lucru după metabolismul hepatic.

Tabelul 1. Considerații comparative ale testelor de mutație

Test HPRT/HGPRT (OCDE 476)

ÎnTest HPRT/HGPRT, culturile de hamster chinezesc (CHO sau V79) sau celulele limfoblastoide umane (TK6) sunt expuse la substanța chimică de testare în prezența unui amestec metabolic S9 ficat de șobolan indus, care furnizează enzime CYP450 necesare pentru a transforma pro -mutageni în specii de reacție a ADN -ului. După un scurt tratament și o perioadă de exprimare de șapte zile, celulele sunt contestate cu 6 -tioguanină; Supraviețuiesc doar clonele care poartă mutații de pierdere a funcției în gena hipoxantină -ghidină fosforibosiltransferază. Prin compararea numărului de colonii mutante cu viabilitatea generală, cercetătorii determină o frecvență de mutație care, dacă este crescută reproductibil atât asupra controalelor concomitente, cât și cele istorice, indică potențialul genotoxic.

Teste TK (OCDE 490 și OCDE 476)

TheTest TK folosește fie celule de limfom de șoarece L5178Y (OCDE 490), fie celule CHO (OCDE 476) heterozigot proiectat la locusul timidinei kinazei. În urma expunerii chimice ± S9 Mix, celulele se recuperează și sunt placate într -un mediu care conține trifluorotimidină, care ucide celulele cu profit TK. Mutanții TK⁻ supraviețuitori formează colonii de peste 10-14 zile, mutanții de coloană mică reflectând adesea evenimente cromozomiale și mutanți de colonie mare care reflectă mutațiile punctului. Ca și în testul HPRT/HGPRT, controalele stricte ale citotoxicității și reperele de mutagen pozitive asigură că creșteri observate ale frecvenței mutației reflectă în mod fiabil riscul genotoxic al unui compus.

4. 4. Evaluarea riscului de cancer

Ficatul de șobolan indus este, de asemenea, utilizat în studiile care vizează evaluarea cancerului - care provoacă potențialul substanțelor. Prin simularea proceselor metabolice care apar în ficatul uman, fracția S9 poate ajuta la identificarea compușilor care ar putea duce la formarea de metaboliți reactivi capabili să se lege la ADN și să provoace mutații care ar putea duce la cancer.

Test Ames îmbunătățit cu ficat de hamster indus S9

Conform ultimelor orientări emise de Agenția Europeană a Medicamentelor (EMA), testul AMES tradițional poate să nu fie suficient de sensibil pentru a detecta potențialul mutagenic al anumitor impurități de n nitrosamină, în special N - nitrosodimetilamină (NDMA), printre altele. Prin urmare, testul AMES îmbunătățit, dezvoltat de Centrul Național pentru Cercetări Toxicologice (NCTR), o divizie a Administrației SUA pentru Alimente și Droguri (FDA), a fost recomandat ca o alternativă mai fiabilă. Testul AME îmbunătățit a introdus adăugarea ficatului de hamster indus S9, care a fost efectuat în conținut 30% ficat de șobolan S9 și 30% ficat de hamster S9. Supernatanții desmosomali de șobolan și hamster (S9) ar trebui să fie preparați din ficatele de rozătoare tratate cu enzimă citocrom P450 - Prin utilizarea ficatului de hamster indus S9, acest test îmbunătățit simulează mai bine metabolismul uman și crește fiabilitatea rezultatelor.

Concluzie

Ficatul de șobolan indus S9 servește ca un instrument critic în testarea genotoxicității, ajutând cercetătorii și agențiile de reglementare să evalueze potențialul mutagenic și cancerigen al substanțelor chimice. Prin furnizarea unui sistem de activare metabolică, îmbunătățește capacitatea testelor precum testul AMES, testele de mutație și studiile de activitate CYP450 pentru a detecta substanțe care necesită activare metabolică pentru a deveni genotoxic. Aplicațiile sale sunt esențiale pentru asigurarea siguranței noilor medicamente, substanțe chimice și produse de consum. Cu rolul său în simularea metabolismului hepatic uman, fracția indusă de ficat de șobolan continuă să fie o parte indispensabilă a toxicologiei moderne și a evaluărilor de siguranță regulatoare.