Hepatocite primare: un instrument crucial pentru avansarea cercetării medicamentoase non -clinice in vitro

Hepatocite primare: un instrument crucial pentru avansarea cercetării medicamentoase non -clinice in vitro

Ficatul, ca organ principal pentru expunerea la medicamente, joacă un rol crucial în procesele de metabolism și toxicitate a medicamentelor. Hepatocitele primare posedă spectrul complet al caracteristicilor celulare și nivelurilor fiziologice ale enzimelor și cofactorilor, inclusiv enzimele legate de membrană - Din acest motiv, hepatocitele primare sunt considerate pe scară largă ca standardul de aur pentru construirea de modele hepatice in vitro și sunt favorizate de cercetătorii în interacțiunea medicamentelor, metabolismul medicamentelor și studiile de toxicitate. Acest articol oferă o imagine de ansamblu a modelelor de cultură 2D și 3D bazate pe hepatocite primare și aplicațiile acestora în dezvoltarea medicamentelor.

Cuvinte cheie: hepatocite primare, cultivare 2d, cultivare 3D, organoizi, co - cultură.

1. 1.. Izolarea hepatocitelor primare

Izolarea hepatocitelor primare este un pas critic în stabilirea modelelor hepatice in vitro, metoda de perfuzie a colagenazei în două trepte fiind cea mai frecvent utilizată. La animalele mai mici, perfuzia hepatică poate fi efectuată prin vena portală sau vena cava inferioară, în timp ce animalele mai mari necesită de obicei perfuzie prin lobii sau segmentele hepatice. Câțiva factori cheie influențează izolarea cu succes a hepatocitelor: în primul rând, colagenaza ar trebui să fie non -citotoxică. În al doilea rând, calendarul digestiei este crucial -Atât sub - Digestie și peste - Digestia pot compromite randamentul și viabilitatea hepatocitelor. În al treilea rând, starea hepatică trebuie să fie optimă, deoarece hepatocitele sunt extrem de sensibile la deteriorarea ischemică. Ficatul utilizat pentru prepararea hepatocitelor trebuie răcit rapid pentru a reduce ratele metabolice și pentru a preveni hipoxia metabolică și ischemia ulterioară.

Standardele pentru hepatocitele primare utilizate în cercetarea medicamentelor sunt următoarele:

1. 2. Cultura primară a hepatocitelor 2d

Modelul de hepatocite de suspensie

Conține droguri complete - Metabolizarea enzimelor și cofactorilor, ceea ce îl face adecvat pentru studierea diferitelor căi de clearance metabolice. Cu toate acestea, viabilitatea hepatocitelor de suspensie și activitatea enzimelor de metabolizare a medicamentului scad treptat pe măsură ce timpul de incubație in vitro crește, limitând timpul de incubație la maximum 4 ore. Acest model este de obicei utilizat pentru a estima clearance -ul medicamentelor cu rate de clearance moderate până la mari. Când rata de eliminare este mai mică de 20%, nu pot fi determinate valori exacte de clearance. Modelele de metabolism in vitro bazate pe hepatocite tradiționale de suspensie - O metodă de releu de hepatocite de suspensie (Figura 1) poate fi utilizată pentru a prelungi timpul de incubație la 20 de ore sau chiar mai mult.

Aplicație:Activitatea enzimelor și studiile de stabilitate metabolică pentru medicamente cu molecule mici.

Figura 1. Suspensie Procesul de transfer al metodei releului hepatocitelor

Sursa: Drug Metab Dispune, 2012,40 (9): 1860-1865

Modelul de hepatocite platabile

Hepatocitele primare sunt cultivate într -un sistem 2D pe plăci de cultură acoperite cu colagen. Hepatocitele prezintă o morfologie epitelială, cu nuclee proeminente, prezentând adesea într -o formă binucleată. Dezavantajele culturii monostratului hepatocitelor unice includ: 1.. Alterarea polarității și funcției celulare.2. Lipsa altor tipuri de celule relevante (adică, celule non -parenchimale) care sunt necesare pentru funcția normală.3. Incapacitatea de a oferi suficienți nutrienți și factori paracrini pentru a sprijini hepatocitele în îndeplinirea funcțiilor lor (cum ar fi acidul biliar și biosinteza proteinelor serice).

Aplicații:

1). Evaluarea medicamentelor - interacțiuni medicamentoase:Aceasta include inducerea enzimelor, inhibarea enzimelor și studiile transportoare. În primul rând, atunci când un medicament acționează ca un inductor, acesta poate duce la o exprimare sporită a enzimelor și a transportatorilor metabolizanți. Inductorii puternici pot regla mai multe gene simultan, cum ar fi inducerea fenobarbitală a CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT și mai multe proteine ​​de transport precum MRP2. În al doilea rând, există specii - Diferențe specifice în modul în care hepatocitele răspund la inductori. De exemplu, rifampicina este un inductor eficient pentru hepatocitele umane și de iepure, dar nu are niciun efect de inducție asupra hepatocitelor de șobolan. În cele din urmă, densitatea de placare suboptimală a hepatocitelor platabile poate duce la o expresie bazală redusă a P450S și la creșterea artificială a răspunsurilor de inducție. Așa cum se arată în figura 3, hepatocitele la densitățile de placare inferioare prezintă o activitate bazală mai mică a CYP1A2, CYP2B6 și CYP3A4, dar răspunsuri de inducție mai puternice. Prin urmare, sunt necesare hepatocite sănătoase la o densitate de placare adecvată pentru a obține date relevante fiziologic.

Figura 2. Relația dintre densitatea de placare a hepatocitelor umane crioprezervate și inducerea enzimei

Sursa: Tehnologii actuale de descoperire a drogurilor, 2010, 7: 188 - 198

2). Evaluarea hepatotoxicității: Observarea modificărilor morfologice la un microscop ușor, cum ar fi morfologia celulară, agregarea vacuolului și a picăturilor lipidice și atașarea/detașarea celulelor. Detectarea necrozei hepatocitelor (așa cum este indicat de aspartat aminotransferază, lactat dehidrogenază și alanină aminotransferază) și apoptoză (fragmentarea ADN -ului). Pentru citotoxicitatea mediată de citokină, culturile monostratice unice ale hepatocitelor nu pot prezice răspunsuri toxice datorate reglării de către substanțele eliberate din celulele vecine non -parenchimale, cum ar fi celulele Kupffer, celulele stelate și celulele endoteliale sinoidale.

3). „Metoda releului” pentru studierea autorizației compuse de metabolizare lentă și a metaboliților săi: Activitatea drogurilor - Metabolizarea enzimelor în hepatocite platabile începe să scadă după 24 de ore de placare. După incubarea hepatocitelor platabile cu seric - mediu liber care conține compusul de interes timp de 24 de ore, mediul este colectat și amestecat, apoi transferat la noi hepatocite platabile pentru studii suplimentare (Figura 3).

Figura 3. Procesul de transfer al metodei releului de releu hepatocite de hepatocite

Sursa: Scrisori de metabolism a drogurilor, 2016, 10: 3 - 15

3). Evaluează absorbția celulară, endocitoza, evadarea endosomală și efectele de tăcere asupra genei țintă a hepatocitului - medicamente mici ale acidului nucleic.

Model de cultivare sandwich

In vitro, hepatocitele pot fi cultivate între două straturi de colagen sau matrigel pentru a reconstrui structurile in vivo, cunoscute sub numele de cultivare sandwich. Hepatocitele cultivate între două straturi de gel - colagen (structura sandwich) pot îmbunătăți morfologia și viabilitatea celulelor și își pot menține funcționalitatea pentru o perioadă mai lungă. Mai mult, hepatocitele în cultura sandwich poate restabili polaritatea, permițând localizarea corectă a transportatorilor bazolaterali și canaliculare, precum și formarea de rețele funcționale de conducte biliare (figura 4).

Figura 4. Expresia polarizată a transportatorilor în modelul sandwich -ului cu hepatocite umane

Sursa: Tehnologii actuale de descoperire a drogurilor, 2010, 7, 188 - 198

Aplicații:

1. 1). Estimarea excreției biliare a compușilor.
2. 2). Evaluarea distribuției hepatice și biliare a compușilor și metaboliților endogeni și exogeni.
3. 3). Estimarea clearance -ului mediat de metabolism și transportatori și construirea fiziologiei - Modele farmacocinetice bazate pe.
4. 4). Studierea hepatotoxicității și furnizarea de mecanisme pentru medicamente clinice - leziuni hepatice induse. Datele sunt integrate în modelele de farmacologie a sistemelor pentru a prezice potențialele leziuni hepatice induse la om.
5.  
   1. 3. Cultura primară a hepatocitelor 3D

6. În sistemele de cultură 3D, hepatocitele sunt cultivate într -o matrice de trei dimensiuni, care imită mai bine arhitectura hepatică in vivo în comparație cu culturile monostrat 2D. Aceste sisteme promovează interacțiunile celulelor și celulelor - matrice, care pot restabili mai multe funcții fiziologice ale ficatului, inclusiv metabolismul medicamentului, secreția de proteine ​​și formarea biliară. Culturile 3D primare de hepatocite pot fi utilizate pentru a studia ficatul - Funcții specifice într -un mediu mai in vivo -, cum ar fi avantaje pentru testarea medicamentelor, evaluarea toxicității și modelarea bolilor.

   Model sferoid

Prin tehnici precum cultura de atașament ultra - Un avantaj al culturii sferoide este faptul că fiecare sferoid necesită doar 1.330 - 2.000 celule, reducând semnificativ numărul de celule în comparație cu alte tehnici de cultură 3D. Studii recente au arătat că culturile sferoide de hepatocite primare pot susține până la 5 săptămâni, activitatea enzimei CYP rămânând aproape neschimbate între ziua 8 și ziua 35. Analiza proteomică a relevat faptul că, în comparație cu cultura sandwich, enzimele responsabile de absorbția de droguri, distribuția, metabolismul și excreția sunt mai bine păstrate timp de 14 zile în cultura sferoidă. Cu toate acestea, ficatul este mult mai complex decât un agregat de celule. Partea bazolaterală a hepatocitelor interacționează cu sângele, în timp ce bilia curge din partea apicală, care este o caracteristică cheie a structurii lobulelor hepatice complexe, iar acest lucru nu poate fi încă replicat în modelul sferoid.

Aplicații:

1. 1). Studiul autorizației compuse de metabolizare lentă și a metaboliților săi.
2. 2). Cercetarea hepatotoxicității.
3. 3). Evaluarea absorbției celulare, a endocitozei, a evacuării endosomale și a efectelor de tăcere asupra genelor țintă ale hepatocitelor - Medicamente mici ale acidului nucleic vizat.

Figura 5. Metoda culturii sferoide

Modelul organoidului hepatic

Definiția consensuală a organoidelor este: structurile 3D derivate din celulele stem, celulele progenitoare sau celulele diferențiate, capabile să reproducă anumite funcții și structuri ale țesutului nativ in vitro, imitând efectiv interacțiunile microambientului in vivo și celulele - Organoidele hepatice au fost identificate drept cel mai avansat model pentru cercetarea biologiei hepatice umane.

Surse celulare pentru construcția organoidă hepatică:

① Celule stem pluripotente (PSC):

Celulele stem embrionare (ESC) și celulele stem pluripotente induse (IPSC) au pluripotență ridicată, plasticitate și capacitate proliferativă nelimitată. Sub influența factorilor de semnalizare specifici, aceștia se diferențiază în hepatocit - Like celule cu activitate și funcție. Cu toate acestea, organoidele hepatice derivate din PSC pot suferi modificări epigenetice și genetice, prezentând modificări de aneuploidie cromozomială în timpul amplificării.

Aplicații:

1. 1). Modele genetice ale bolilor hepatice
2. 2). Modele de boli hepatice infecțioase
3. 3). Testarea citotoxicității medicamentoase

② Tissul hepatic - Celule derivate: Acestea includ colangiocite și hepatocite. Hepatocitele mature păstrează potențialul celulelor stem și capacitatea proliferativă în medii specifice. În comparație cu organoidele derivate PSC, organoizii derivați din țesutul primar sunt mai maturi, cu genomuri mai stabile și mențin stabilitate fenotipică și genetică în timpul culturii in vitro pe termen lung. Cu toate acestea, capacitatea proliferativă pe termen lung a organoidelor de hepatocite umane mature este limitată în comparație cu hepatocitele umane fetale sau cu hepatocitele primare de șoarece pentru adulți. Cultivarea organoidelor de hepatocite pentru adulți rămâne dificilă.

Metoda culturii (figura 6): țesutul hepatic este digerat în celule unice, iar un amestec de matrigel și celule este însămânțat într -o placă de 24 - puț pentru a forma structuri în formă de cupolă - Incubați într -un incubator de cultură celulară (37 ° C) timp de 15 minute. După solidificare, adăugați un mediu de cultură specific. Trecere după aproximativ 14 zile. Înlocuiți mediul inițial cu mediu de diferențiere după 7 - 10 zile.

Aplicații:

1. 1). Modele de hepatotoxicitate
2. 2). Studii de tulburare de metabolism in vitro
3. 3). Boala hepatică grasă non -alcoolică
4. 4). Dezvoltarea drogurilor pentru boli hepatice benigne și maligne

Figura 6. Cultura și procesul de trecere a țesuturilor - organoide hepatice derivate

Sursa: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

Comparația culturii sferoide și a culturii organoide

4. Modelul de cultură de hepatocite primare

1. 1. 2d primar hepatocite co - Model de cultură
      

      În modelul de cultură de hepatocite primare 2D, două sau mai multe tipuri de celule diferite sunt mixte și cultivate într -un mediu cu două dimensiuni. Caracteristica cheie a acestui model este interacțiunea directă între diferite tipuri de celule, interacțiunea dintre celule și matricea extracelulară sau transmisia indirectă a semnalului prin citokine și comunicații chimice. Funcțiile primare ale hepatocitelor, cum ar fi producția de albumină și capacitatea de metabolism a medicamentelor, pot fi menținute până la trei săptămâni.

      Aplicații:

      1. 1). Hepatocite primare co -cultivate cu fibroblaste: Acest model este utilizat pentru studierea ratei de eliberare a compușilor de metabolizare lent - metabolizant și a metaboliților acestora.
      2. 2). Hepatocitele primare co -cultivate cu celule hepatice non -parenchimatoase (de exemplu, celule stelate, celule endoteliale sinusoidale): Acest model este util pentru cercetarea leziunilor hepatice induse de droguri (DILI), deoarece ajută la investigarea rolului citokinelor, a chemokinelor și a factorilor de creștere în modularea răspunsurilor adaptative ale medicamentelor după expunerea medicamentului.
      3. 3). Hepatocite primare co -cultivate cu celule T: Acest model este utilizat pentru a detecta metabolismul medicamentului hepatic - Răspunsuri specifice ale celulelor T.
      4. 4). Hepatomax ™ de iPhaseCO - Sistem de cultură: Ifase a dezvoltat un sistem de cultură CO cu hepatocite primare din diferite specii, cunoscut sub numele de Hepatomax™. Prin cultivarea hepatocitelor primare umane cu celule stromale, este posibil să se mențină un bun medicament - metabolizarea activității enzimei în hepatocitele umane până la 3 săptămâni. Acest sistem este potrivit pentru studierea ratelor de eliberare a compusului lent - metabolizare și a metaboliților acestora.

      Acest model de cultură oferă o platformă mai relevantă din punct de vedere fiziologic pentru evaluarea metabolismului medicamentelor, a toxicității și a proceselor de boală legate de ficat - Oferind informații despre modul în care diferite tipuri de celule contribuie la funcția hepatică și la boala.
      
      

      3D Primar Hepatocit Co - Model de cultură

      Direct 3d Co - Cultură: Acest model implică amestecarea a două sau mai multe tipuri diferite de celule hepatice (de exemplu, hepatocite primare, celule endoteliale sinusoidale, celule stelate hepatice, celule Kupffer) pentru a forma sferoide auto -asamblate sau co - Cultura directă 3D Co - permite interacțiunea strânsă între diferite celule hepatice prin mecanisme precum celula - la - aderența celulelor, semnalizarea paracrinei prin citokine solubile și adeziunea matricei extracelulare, permițând comunicarea între hepatocite.

      Aplicații:

      1. 1). Model de fibroză hepatică: utilizat pentru a studia mecanismele și progresia fibrozei hepatice.
      2. 2). Modelul de leziuni hepatice induse de droguri (DILI): ajută la simularea și evaluarea leziunilor hepatice cauzate de medicamente.
      3. 3). Interacțiuni medicamentoase, metabolismul medicamentelor și inducția enzimei: evaluează modul în care interacționează diferite medicamente, cum sunt metabolizate și cum induc enzimele hepatice.

      COL CO - CULTURA: Această metodă folosește un sistem de separare fizică (de exemplu, transwell sau alte materiale) pentru a cultiva două sau mai multe tipuri de celule (cum ar fi hepatocitele primare cu celule NIH/3T3 sau celule endoteliale sinusoidale) într -un mediu 3D, unde se împiedică contactul celular direct pentru celule. Comunicarea dintre celule are loc prin citokine solubile.

      Aplicații:
      Utilizat pentru studierea comunicării non -contact între celulele hepatice din organism.

      
      În rezumat, ifaza, ca lider în cercetarea biologică in vitro, oferă soluții cuprinzătoare pentru testarea medicamentelor non -clinice. De la izolarea și cultura hepatocitelor primare de la diverse specii până la dezvoltarea de produse de sprijin, cum ar fi media de cultură pentru aplicații specifice sau plăci de colagen cu mai multe specificații - Suntem un partener de încredere pentru clienții din industria farmaceutică, angajat să furnizeze soluții de tăiere -