Индуцированная фракция печени крысы: система метаболической активации для генотоксичности и мутаций in vitro

Ключевые слова: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, Тест на мутации, генотоксичность, генетическая токсичность, индуцированная печень крысы S9, тест Ames, тест мини -айм, хромосомная аберрация, микроямклеус, анализ HPRT/HGPRT, анализ TK, анализ TK, TK -анализ, анализ TK, TK -анализ, анализ TK, анализ TK, анализ TK, анализ TK, анализ TK, анализ TK, анализ TK, анализ TK, анализ TK, анализ TK, анализ TK, анализ TK, анализ TK, анализ TK, анализ TK, анализ TK, анализ TK, анализ HPRT/HGPR

Ифазный продукт

Введение

Индуцированная печень крысы S9является ключевым компонентом при оценкеГенетическая токсичностьПотенциал химических веществ, особенно в регуляторной токсикологии. Он обычно используется в сочетании с анализами in vitro, такими какЭймс Тест иМутационные тесты, чтобы оценить мутагенные свойства соединений. Предоставляя ферментативную систему, богатую цитохромом P450 (CYP450), индуцированная фракция печени крысы играет решающую роль в моделировании метаболических процессов, которые происходят в печени, помогая определить, могут ли химические вещества потенциально вызывать генетические мутации или рак.

Индуцированная печень крысы S9

Фракция печени S9 относится к супернатанту Post - Митохондриальный, полученный из гомогенатов печени крысы после серии стадий центрифугирования. Термин «индуцированный» относится к лечению крыс специфическими соединениями, которые усиливают активность ферментов печени, особенно ферменты цитохрома P450 (CYP450), которые ответственны за метаболизм широкого диапазона ксенобиотиков.

Индуцированная фракция S9 печени крысы содержит множество ферментов, которые участвуют в метаболизме фазы I и фазы II химических веществ. Это включает в себя ферменты, такие как цитохром P450 монооксигеназы, которые облегчают окислительную биотрансформацию субстратов, тем самым имитируя метаболизм печени человека.

Активность CYP450 и метаболическая активация

Семейство ферментов цитохрома P450 (CYP450) играет ключевую роль в метаболизме широкого спектра веществ, в том числе многие фармацевтические препараты, химические вещества в окружающей среде и канцерогены. Индуцированная фракция печени крысы содержит эти ферменты и имеет важное значение для оценки химических веществ, которые могут стать генотоксичными только после метаболической активации.

Многие соединения первоначально не токсичны, но могут стать токсичными после метаболизма в печени. Эти Pro - Mutagens (которые требуют метаболической активации, чтобы стать мутагенной), и Pro - Канцерогены (которые требуют активации, вызывающей рак), могут быть обнаружены только с помощью анализов, которые включают систему метаболической активации S9. Без индукции метаболических ферментов, таких как CYP450, эти вещества могут показаться безвредными в стандартных тестах на генотоксичность.

Добавляя индуцированную печень крысы в ​​анализы in vitro, исследователи могут оценить, как вещество взаимодействует с ферментами CYP450. Это особенно важно для фармацевтических препаратов, так как метаболизм ферментами CYP450 является критическим этапом в фармакокинетике многих лекарств.

Применение индуцированной печени крысы S9

1. 1. Тест Эймса (OECD 471)

Тест Эймса, описанный в руководствеОЭСР 471, является одним из наиболее хорошо известных и широко используемых методов оценки мутагенности. Он включает в себя обнаружение штаммов бактерий сальмонеллы на тестовый химический веществ, чтобы увидеть, индуцирует ли оно мутации, которые заставляют бактерии возвращаться к независимому состоянию гистидина.

Для моделирования метаболического процесса человека в тестовую систему часто добавляют индуцированную печень крысы. Фракция S9 обеспечивает необходимые ферменты, включая CYP450, которые могут потребоваться для метаболизации соединения в более реактивную форму, которая может вызвать мутации в бактериальной ДНК. Эта комбинация S9 с тестом Ames позволяет провести более полную оценку мутагенного потенциала, имитируя как прямые, так и метаболически активированные мутагенные механизмы.

2. 2.Испытания на мутации (тест на хромосомную аберрацию, тест на микрояд и другие анализы in vitro)

В дополнение к тесту AMES, мутационные тесты обычно используются для оценки генотоксического потенциала химических веществ. Эти тесты являются более полными при оценке ряда генетических повреждений, включая хромосомные мутации, генные мутации и образование микрояд. Индуцированная печень крысы используется в тестах на мутации по следующим причинам:

Тест на микрояд (OECD 487)

В этом тесте обнаруживается образование микроямклеев в клетках, которые представляют собой небольшие экстрануклеарные тела, содержащие фрагменты хромосом или целых хромосом, которые не были включены в ядро ​​во время деления клеток. А Тест микроядможет обнаружить кластогенные (хромосома - Разрыв) и анеугенических (влияющих на число хромосом). Индуцированная печень крысы S9 используется для активации метаболического активации вещества, так как некоторые химические вещества вызывают только повреждение хромосом после того, как они метаболизируются ферментами печени. Фракция S9 повышает чувствительность теста, моделируя метаболическую активацию, которая может происходить in vivo.

Тест на хромосомную аберрацию (ОЭСР 473)

Этот тест оценивает, может ли вещество привести к структурному повреждению хромосом, индуцируя разрывы, делеции, транслокации или другие типы аберраций. Как тест на микрояклеус,Тест хромосомной аберрацииможет применяться с или без метаболической активации. Индуцированная печень крысы добавляется в тестовую систему, чтобы имитировать метаболические процессы в печени, что позволяет оценить вещества, которые могут не вызвать хромосомное повреждение в их первоначальной форме, но могут сделать это после метаболизма печени.

Таблица 1. Сравнительные соображения тестов на мутации

Анализ HPRT/HGPRT (OECD 476)

ВHPRT/HGPRT Анализ, культуры китайских хомяков (CHO или V79) или лимфобластоидных клеток человека (TK6) подвергаются подверженности тестовым химическим веществам в присутствии индуцированной метаболической смеси печени крысы, которая поставляет ферменты CYP450, необходимые для преобразования про -мутагенсов в ДНК -реактивирующие виды. После краткого лечения и периода семидневной экспрессии клетки бросают вызов 6 -тиогуанину; Только клоны, несущие мутации по утрат -функции в гипоксантино -гуаниновой фосфорибозилтрансферазе, выживают. Сравнивая количество мутантных колоний с общей жизнеспособностью, исследователи определяют частоту мутации, которая, если они воспроизводимо повышен как по одновременному, так и в историческом контроле, указывает на генотоксический потенциал.

TK -анализы (OECD 490 & OECD 476)

АTK Assay Использует либо L5178Y мышиных клеток мыши (OECD 490), либо клетки CHO (ОЭСР 476) Инженерный гетерозиготный в локусе тимидинкиназы. После смешивания химического воздействия ± S9 клетки восстанавливаются и вытягивают в среду, содержащую трифторотимидин, который убивает TK -продукцию клеток. Выжившие мутанты TK⁻ образуют колонии в течение 10–14 дней, с небольшими колоническими мутантами, которые часто отражают хромосомные события и крупно -колонии мутантов, отражающих точечные мутации. Как и в анализе HPRT/HGPRT, строгие контроль цитотоксичности и положительные критерии мутагенов гарантируют, что наблюдаемое увеличение частоты мутации надежно отражает генотоксический риск соединения.

4. 4. Оценка риска рака

Индуцированная печень крысы S9 также используется в исследованиях, направленных на оценку рака - вызывающий потенциал веществ. Моделируя метаболические процессы, которые происходят в печени человека, фракция S9 может помочь идентифицировать соединения, которые могут привести к образованию реактивных метаболитов, способных связываться с ДНК, и вызывая мутации, которые могут привести к раку.

Enhanced Ames тест с индуцированной печенью печенью Hamster S9

Согласно последним рекомендациям, выпущенным Европейским агентством лекарств (EMA), традиционный тест Ames может быть недостаточно чувствительным, чтобы обнаружить мутагенный потенциал некоторых примесей нитрозамина, особенно N - Нитрозодиметиламин (NDMA), среди прочего. Таким образом, тест на усиление AMES, разработанный Национальным центром токсикологических исследований (NCTR), подразделение Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и лекарств США (FDA), было рекомендовано в качестве более надежной альтернативы. Enhanced Ames -тест ввел добавление индуцированной печени печени хомяка, которое выполнялось при содержании 30% печени крысы S9 и 30% печени печени хомяка S9. Десмосомные супернатанты крысы и хомяка (S9S) должны быть приготовлены из печени грызунов, обработанных ферментом цитохрома P450 - Индуцирующие вещества. Используя индуцированную печень печени хомяка S9, этот улучшенный тест лучше имитирует метаболизм человека и повышает надежность результатов.

Заключение

Индуцированная печень крысы S9 служит критическим инструментом в тестировании генотоксичности, помогая исследователям и регуляторным агентствам оценить мутагенный и канцерогенный потенциал химических веществ. Предоставляя систему метаболической активации, она повышает способность анализов, таких как тест AMES, тесты на мутации и исследования активности CYP450 для обнаружения веществ, которые требуют метаболической активации, чтобы стать генотоксичной. Его применение необходимо для обеспечения безопасности новых лекарств, химических веществ и потребительских товаров. С его ролью в моделировании метаболизма печени человека индуцированная фракция печени крысы продолжает оставаться незаменимой частью современной токсикологии и регуляторной оценки безопасности.