Первичные гепатоциты: важнейший инструмент для развития не - Клинические исследования лекарств in vitro in vitro

Первичные гепатоциты: важнейший инструмент для развития не - Клинические исследования лекарств in vitro in vitro

Печень, как основной орган для воздействия лекарственного средства, играет решающую роль в метаболизме лекарств и процессах токсичности. Первичные гепатоциты обладают полным спектром клеточных характеристик и физиологических уровней ферментов и кофакторов, включая мембраны - связанные ферменты, такие как цитохром P450 (смешанная оксидаза в гладком эндоплазматическом ретикулуме) и цитозольные эстеразы, энкантизирующие все метаболические пути, обнаруженные в печеночной. По этой причине первичные гепатоциты широко рассматриваются как золотой стандарт для построения моделей печени in vitro и предпочитают исследователи в области взаимодействия лекарств, метаболизма лекарств и токсичности. В этой статье представлен обзор моделей 2D и 3D -культуры, основанных на первичных гепатоцитах и ​​их применения в разработке лекарств.

Ключевые слова: первичные гепатоциты, 2D выращивание, 3D выращивание, органоиды, Co - Culture.

1. 1. Выделение первичных гепатоцитов

Выделение первичных гепатоцитов является критическим шагом в создании моделей печени in vitro, причем наиболее часто используется метод перфузии с двумя шагами коллагеназы. У меньших животных перфузия печени может быть выполнена через портальную вену или нижнюю половую каву, в то время как более крупные животные обычно требуют перфузии через доли печени или сегменты. Несколько ключевых факторов влияют на успешную изоляцию гепатоцитов: во -первых, коллагеназа должна быть не - цитотоксичным. Во -вторых, время пищеварения имеет решающее значение -Как в рамках - пищеварение, так и перевариваемое пищеварение могут поставить под угрозу выход и жизнеспособность гепатоцитов. В -третьих, состояние печени должно быть оптимальным, так как гепатоциты очень чувствительны к ишемическому повреждению. Печень, используемая для подготовки гепатоцитов, должна быстро охлаждаться, чтобы снизить скорость метаболизма и предотвратить метаболическую гипоксию и последующую ишемию.

Стандарты первичных гепатоцитов, используемых в исследованиях лекарств, следующие:

1. 2. Первичная 2D -культура гепатоцитов

Модель гепатоцита подвески

Он содержит полный препарат - Метаболизирующие ферменты и кофакторы, что делает его подходящим для изучения различных путей метаболического клиренса. Тем не менее, жизнеспособность гепатоцитов суспензии и активность лекарственных метаболизирующих ферментов постепенно уменьшаются по мере увеличения времени инкубации in vitro, ограничивая время инкубации до максимум 4 часа. Эта модель обычно используется для оценки клиренса лекарств с умеренным или высоким уровнем клиренса. Когда скорость клиренса составляет менее 20%, нельзя определить точные значения клиренса. Традиционные подвесные гепатоциты - На основе моделей метаболизма in vitro недостаточны для создания обнаруживаемых метаболических реакций для медленного - Метаболизирующих соединений, что ограничивает их способность прогнозировать скорости клиренса и метаболические продукты этих соединений. Метод ретрансляции гепатоцитов подвески (рис. 1) может использоваться для продления времени инкубации до 20 часов или даже дольше.

Приложение:Активность ферментов и исследования метаболической стабильности для мелких молекулярных препаратов.

Рисунок 1. Процесс переноса метода эстафеты гепатоцитов подвески

Источник: Metab Metab Metab, 2012,40 (9): 1860–1865

Модель гепатоцитов платформы

Первичные гепатоциты культивируются в 2D -системе на коллагеном - Объединенные культурные пластины. Гепатоциты демонстрируют эпителиальную морфологию с выступающими ядрами, часто представляющимися в двукратном виде. Недостатки однослойной культуры одиночной гепатоцитов включают в себя: 1. Изменение полярности и функции клеток. Отсутствие других соответствующих типов клеток (то есть не - паренхимальных клеток), которые необходимы для нормальной функции. Неспособность обеспечить достаточные питательные вещества и паракринные факторы для поддержки гепатоцитов в выполнении их функций (таких как биосинтез желчных кислот и сывороточного белка).

Приложения:

1). Оценка препарата - взаимодействие лекарств:Это включает в себя индукцию ферментов, ингибирование ферментов и исследования транспорта. Во -первых, когда препарат действует как индуктор, это может привести к повышению экспрессии лекарственных средств, метаболизирующих ферменты и транспортеры. Сильные индукторы могут одновременно активировать несколько генов, таких как индукция фенобарбитала CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT и нескольких транспортных белков, таких как MRP2. Во -вторых, есть виды - конкретные различия в том, как гепатоциты реагируют на индукторы. Например, рифампицин является эффективным индуктором для гепатоцитов человека и кроликов, но не имеет индукционного влияния на гепатоциты крыс. Наконец, субоптимальная плотность покрытия платтных гепатоцитов может привести к снижению базальной экспрессии p450 и искусственно увеличению индукционных реакций. Как показано на рисунке 3, гепатоциты при более низких плотностях покрытия демонстрируют более низкую базальную активность CYP1A2, CYP2B6 и CYP3A4, но более сильные индукционные реакции. Следовательно, здоровые гепатоциты при соответствующей плотности покрытия необходимы для получения физиологически значимых данных.

Рисунок 2. Связь между плотностью нанесения криоконсервированных гепатоцитов человека и индукцией ферментов

Источник: текущие технологии обнаружения лекарств, 2010, 7: 188 - 198

2). Оценка гепатотоксичности: Наблюдая за морфологическими изменениями под световым микроскопом, такими как морфология клеток, агрегация вакуоли и липидов и прикрепление/отряд клеток. Обнаружение некроза гепатоцитов (о чем свидетельствует аспартат -аминотрансфераза, лактатдегидрогеназа и аланин аминотрансфераза) и апоптоз (фрагментация ДНК). Для цитокинов - опосредованная цитотоксичность отдельные монослойные культуры гепатоцитов не могут прогнозировать токсические ответы из -за регуляции веществами, высвобождаемыми из соседних не - паренхимальных клеток, таких как клетки Купфера, звездчатые клетки и синусоидальные эндотелиальные клетки.

3). «Метод эстафеты» для изучения медленного метаболизирующего составного разрешения и его метаболитов: Активность лекарственного средства - метаболизирующие ферменты в платтных гепатоцитах начинают уменьшаться после 24 часов покрытия. После инкубации платтных гепатоцитов с сывороткой, свободной средой, содержащей интересующее соединение в течение 24 часов, среду собирают и смешивают, а затем переносят в новые платтные гепатоциты для дальнейшего изучения (рис. 3).

Рисунок 3. Платтечный процесс передачи метода ретрансляции гепатоцитов

Источник: Письма о метаболизме наркотиков, 2016, 10: 3 - 15

3). Оцените клеточное поглощение, эндоцитоз, эндосомальный побег и молчание на ген -мишень гепатоцитов - нацеленные на мелкие лекарственные средства для нуклеиновых кислот.

Модель культивирования сэндвича

В in vitro гепатоциты могут культивироваться между двумя слоями коллагена или матригеля для восстановления структур in vivo, известных как культивирование сэндвичей. Гепатоциты, культивируемые между двумя слоями геля -коллагена (сэндвич -структура), могут улучшить морфологию и жизнеспособность клеток и поддерживать их функциональность в течение более длительного периода. Кроме того, гепатоциты в сэндвич -культуре могут восстановить полярность, что позволяет обеспечить правильную локализацию базолатеральных и канальских переносчиков, а также образование функциональных сетей желчных протоков (рис. 4).

Рисунок 4. Поляризованная экспрессия транспортеров в модели сэндвича с гепатоцитами человека

Источник: текущие технологии Discovery Discovery, 2010, 7, 188 - 198

Приложения:

1. 1). Оценка выброса желчника соединений.
2. 2). Оценка печеночного и желчного распределения эндогенных и экзогенных соединений и метаболитов.
3. 3). Оценка клиренса, опосредованного метаболизмом и транспортерами, и построение физиологии - Фармакокинетические модели на основе.
4. 4). Изучение гепатотоксичности и обеспечение механизмов для клинического препарата - индуцированное повреждение печени. Данные интегрированы в системные модели фармакологии для прогнозирования потенциального препарата, вызванного повреждением печени у людей.
5.  
   1. 3. Первичная 3D -культура гепатоцитов

6. В 3D -культурных системах гепатоциты культивируются в трехмерной матрице, которая лучше имитирует архитектуру печени in vivo по сравнению с 2D -монослойными культурами. Эти системы способствуют клеточным взаимодействиям клеток и клеток - Матрикс, которые могут восстановить больше физиологических функций печени, включая метаболизм лекарственного средства, секрецию белка и образование желчи. Первичные 3D -культуры гепатоцитов могут быть использованы для изучения печени - Специфические функции в более in vivo - похожа на окружающую среду, предлагая преимущества для тестирования на наркотики, оценки токсичности и моделирования заболеваний.

   Модель сфероида

С помощью таких методов, как Ultra - Низкая культура привязанности, висящая культура капли и культуру магнитных клеток (рис. 5), первичные гепатоциты могут агрегировать в сфероидальные агрегаты диаметром до 150 - 175 мкм, не полагаясь на внешние матрицы. Одним из преимуществ сфероидной культуры является то, что каждому сфероиду требуется всего 1330 - 2000 клеток, что значительно уменьшает количество клеток по сравнению с другими методами трехмерной культуры. Недавние исследования показали, что первичные сфероидные культуры гепатоцитов могут выдерживать в течение 5 недель, при этом активность фермента CYP остается почти неизменной между 8 и 35 -м днем. Анализ протеомики показал, что по сравнению с культурой сэндвичей, ферментами, ответственными за абсорбцию лекарств, дистрибутив, метаболизм и экскрецию, сохраняются для 14 дней в культуре сфероидов. Тем не менее, печень гораздо сложнее, чем клеточный агрегат. Базолатеральная сторона гепатоцитов взаимодействует с кровью, в то время как желчь вытекает с апикальной стороны, которая является ключевой особенностью сложной структуры печени, и это еще не может быть воспроизведено в модели сфероида.

Приложения:

1. 1). Изучение медленного метаболизирующего составного разрешения и его метаболитов.
2. 2). Исследование гепатотоксичности.
3. 3). Оценка поглощения клеток, эндоцитоза, эндосомального выхода и влияния молчания на генах мишеней гепатоцитов - целенаправленные лекарственные средства для мелких нуклеиновых кислот.

Рисунок 5. Метод сфероидной культуры

Модель органоидов печени

Консенсусное определение органоидов: 3D -структуры, полученные из стволовых клеток, клеток -предшественников или дифференцированных клеток, способных воспроизводить определенные функции и структуры нативной ткани in vitro, эффективно имитируя микроокружение in vivo и клетки - клетки. Органоиды печени были идентифицированы как наиболее продвинутая модель для исследований биологии печени человека.

Клеточные источники для строительства органоидов печени:

① Плюрипотентные стволовые клетки (PSC):

Эмбриональные стволовые клетки (ESCS) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (IPSC) обладают высокой плюрипотентностью, пластичностью и неограниченной пролиферативной способностью. Под влиянием специфических сигнальных факторов они дифференцируются в гепатоциты - как клетки с активностью и функцией. Тем не менее, органоиды печени, полученные из PSC, могут подвергаться эпигенетическим и генетическим изменениям, демонстрируя хромосомные анеуплоидные изменения во время амплификации.

Приложения:

1. 1). Модели генетических заболеваний печени
2. 2). Инфекционные модели заболеваний печени
3. 3). Тестирование на цитотоксичность лекарственного средства

② Ткань печени - Полученные клетки: К ним относятся холангиоциты и гепатоциты. Зрелые гепатоциты сохраняют потенциал стволовых клеток и пролиферативную способность в конкретных средах. По сравнению с производными органоидами PSC, органоиды, полученные из первичной ткани, являются более зрелыми, с более стабильными геномами и поддерживают фенотипическую и генетическую стабильность в течение длительной культуры in vitro. Тем не менее, длинная пролиферативная способность зрелых органоидов гепатоцитов человека ограничена по сравнению с гепатоцитами человека плода или первичными гепатоцитами у взрослых. Культивирование органоидов для взрослых гепатоцитов остается сложным.

Метод культивирования (рис. 6): ткань печени расщепляется в отдельные клетки, а смесь матригеля и клеток высетана в пластине 24 - скважины с образованием купольных структур. Инкубируйте в инкубаторе клеточной культуры (37 ° C) в течение 15 минут. После затвердевания добавьте специфическую культуральную среду. Проход примерно через 14 дней. Замените исходную среду на среду дифференциации через 7 - 10 дней.

Приложения:

1. 1). Модели гепатотоксичности
2. 2). Исследования расстройства метаболизма in vitro
3. 3). Не - алкогольная жировая болезнь печени
4. 4). Разработка лекарств при доброкачественных и злокачественных заболеваниях печени

Рисунок 6. Культура и процесс прохождения ткани - Полученные органоиды печени

Источник: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

Сравнение сфероидной культуры и органоидной культуры

4. Первичные гепатоциты CO - Культурная модель

1. 1. 2D первичные гепатоциты Co - Культурная модель
      

      В модели 2D первичной гепатоцитов CO - культуральная модель два или более разные типы клеток смешаны и культивируются в среде с двумя размерными. Ключевой особенностью этой модели является прямое взаимодействие между различными типами клеток, взаимодействие между клетками и внеклеточным матриксом или косвенной передачи сигнала посредством цитокинов и химической связи. Первичные функции гепатоцитов, такие как продукция альбумина и способность метаболизма лекарств, можно поддерживать в течение до трех недель.

      Приложения:

      1. 1). Первичные гепатоциты Co - Культируют с фибробластами: эта модель используется для изучения скорости клиренса медленных - метаболизирующих соединений и их метаболитов.
      2. 2). Первичные гепатоциты, культивируемые с не - паренхимальными клетками печени (например, звездчатые клетки, синусоидальные эндотелиальные клетки): эта модель полезна для исследования препарата, вызванного повреждением печени (DILI), поскольку она помогает исследовать роль цитокинов, хемокинов и факторов роста в адаптивных реакциях в печени после воздействия лекарственного препарата.
      3. 3). Первичные гепатоциты Co - Культируется с Т -клетками: эта модель используется для обнаружения метаболизма лекарств в печени - Специфические ответы Т -клеток.
      4. 4). Iphase Hepatomax ™CO - Система культивирования: Iphase разработала систему культивирования CO - с первичными гепатоцитами из разных видов, известных как Hepatomax™Полем При культивировании первичных гепатоцитов человека со стромальными клетками можно поддерживать хороший препарат - Метаболизирующая активность ферментов в гепатоцитах человека в течение до 3 недель. Эта система подходит для изучения медленного - Метаболизируя скорости зазора соединений и их метаболиты.

      Эта модель культуры обеспечивает более физиологически актуальную платформу для оценки метаболизма лекарственного средства, токсичности и процессов, связанных с заболеванием печени, предлагая представление о том, как различные типы клеток способствуют функции печени и заболеваниям.
      
      

      3D первичные гепатоциты Co - культурная модель

      Direct 3D CO - Культура: Эта модель включает в себя смешивание двух или более разных типов клеток печени (например, первичные гепатоциты, синусоидальные эндотелиальные клетки, звездчатые клетки печени, клетки Купфера) для образования самооценки сфероидов или культивирования их в трехмерной среде, построенной с такими материалами, как коллаген, фибрин, альгинат или гидрогели. Прямая 3D CO - Культура позволяет тесно взаимодействовать между различными клетками печени посредством таких механизмов, как клетка - к клеточной адгезии, паракринная передача сигналов с помощью растворимых цитокинов и адгезии внеклеточного матрикса, обеспечивая связь между гепатоцитами.

      Приложения:

      1. 1). Модель фиброза печени: используется для изучения механизмов и прогрессирования фиброза печени.
      2. 2). Препарат - Индуцированная повреждение печени (DILI) Модель: помогает имитировать и оценить повреждение печени, вызванные лекарственными средствами.
      3. 3). Взаимодействие лекарственного средства, метаболизм лекарств и индукция фермента: оценивает, как различные лекарства взаимодействуют, как они метаболизируются, и как они индуцируют ферменты печени.

      Косвенное 3D CO - КультураВ этом методе используется система физического разделения (например, трансвелл или другие материалы) для культивирования двух или более типов клеток (таких как первичные гепатоциты с клетками NIH/3T3 или синусоидальные эндотелиальные клетки) в трехмерной среде, где предотвращается прямая клетка - Клеточный контакт. Связь между клетками происходит через растворимые цитокины.

      Приложения:
      Используется для изучения не - Контактной связи между клетками печени в организме.

      
      Таким образом, Iphase, как лидер в биологических исследованиях in vitro, предоставляет комплексные решения для не - Клинического тестирования на лекарства. От изоляции и культуры первичных гепатоцитов от различных видов до разработки вспомогательных продуктов, таких как культуральные среды для конкретных применений или мульти -спецификации коллагена - покрытые пластины, ифаза, предназначенная для предложения лучших инструментов исследовательских инструментов in vitro для обнаружения и разработки лекарств. Мы являемся надежным партнером для клиентов в фармацевтической промышленности, приверженных предоставлению режущих решений для не - клинических исследований.