Indukovaná frakcia pečene potkanov S9: metabolický aktivačný systém pre testy genotoxicity a mutácie in vitro

Kľúčové slová: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, Test mutácie, genotoxicita, genetická toxicita, indukovaná pečeň S9, Test AMES, test mini ames, chromozomálna aberácia, mikronukleus, HPRT/HGPRT test, test TK

Produkt

Zavedenie

Indukovaná pečeň potkanov S9je kľúčovou súčasťou pri hodnotenígenetická toxicitaPotenciál chemikálií, najmä pri regulačnej toxikológii. Bežne sa používa v kombinácii s in vitro testmi, ako napríkladAMES Test amutačné testy, vyhodnotiť mutagénne vlastnosti zlúčenín. Poskytnutím enzymatického systému bohatého na cytochróm P450 (CYP450), indukovaná frakcia pečene potkana S9 hrá rozhodujúcu úlohu pri simulácii metabolických procesov, ktoré sa vyskytujú v pečeni, čo pomáha určiť, či chemikálie môžu potenciálne spôsobiť genetické mutácie alebo rakovinu.

Indukovaná pečeň potkanov S9

Frakcia pečene S9 sa vzťahuje na post - mitochondriálny supernatant získaný z homogenátov pečene potkanov po sérii odstredivých krokov. Pojem „indukovaný“ sa týka liečby potkanov špecifickými zlúčeninami, ktoré zvyšujú aktivitu pečeňových enzýmov, najmä enzýmov cytochrómu P450 (CYP450), ktoré sú zodpovedné za metabolizmus širokého rozsahu xenobiotikum.

Indukovaná frakcia pečene potkana S9 obsahuje rôzne enzýmy, ktoré sú zapojené do metabolizmu chemikálií fázy I a fázy II. Patria sem enzýmy, ako sú cytochróm P450 monooxygenázy, ktoré uľahčujú oxidačnú biotransformáciu substrátov, čím napodobňujú metabolizmus ľudskej pečene.

Aktivita CYP450 a metabolická aktivácia

Rodina enzýmov cytochrómu P450 (CYP450) hrá kľúčovú úlohu v metabolizme širokej škály látok, vrátane mnohých farmaceutík, environmentálnych chemikálií a karcinogénov. Indukovaná frakcia pečene potkana S9 obsahuje tieto enzýmy a je nevyhnutná na hodnotenie chemikálií, ktoré sa môžu stať genotoxickými po metabolickej aktivácii.

Mnoho zlúčenín je spočiatku neto toxické, ale po metabolizme v pečeni sa môže stať toxickými. Tieto pro - mutagény (ktoré vyžadujú, aby sa metabolická aktivácia stala mutagénnou) a pro - karcinogény (ktoré vyžadujú aktiváciu spôsobujúcu rakovinu) sa môžu zistiť iba prostredníctvom testov, ktoré obsahujú systém metabolického aktivácie S9. Bez indukcie metabolických enzýmov, ako je CYP450, sa tieto látky môžu javiť ako neškodné pri štandardných testoch genotoxicity.

Pridaním indukovanej pečene potkana S9 do testov in vitro môžu vedci vyhodnotiť, ako látka interaguje s enzýmami CYP450. Toto je obzvlášť dôležité pre farmaceutiká, pretože metabolizmus enzýmov CYP450 je kritickým krokom vo farmakokinetike mnohých liekov.

Aplikácie indukovanej pečene potkana S9

1. 1. Test AME (OECD 471)

Test AMES, uvedený v usmerneníOECD 471, je jednou z najznámejších a najpoužívanejších metód na hodnotenie mutagénnosti. Zahŕňa to vystavenie kmeňov baktérií salmonely testovanej chemikálii, aby sa zistilo, či indukuje mutácie, ktoré spôsobujú, že sa baktérie vrátia do nezávislého stavu histidínu.

Na simuláciu ľudského metabolického procesu sa do testovacieho systému často pridáva indukovaná pečeň s potkanmi S9. Frakcia S9 poskytuje potrebné enzýmy vrátane CYP450, ktoré môžu byť potrebné na metabolizáciu zlúčeniny do reaktívnejšej formy, ktorá by mohla spôsobiť mutácie v bakteriálnej DNA. Táto kombinácia S9 s testom AMES umožňuje komplexnejšie hodnotenie mutagénneho potenciálu napodobňovaním priamych aj metabolicky aktivovaných mutagénnych mechanizmov.

2. 2.Testy mutácií (chromozomálny aberačný test, test mikronukleus a ďalšie testy in vitro)

Okrem testu AMES sa mutačné testy bežne používajú na vyhodnotenie genotoxického potenciálu chemikálií. Tieto testy sú komplexnejšie pri hodnotení rozsahu genetického poškodenia, vrátane chromozomálnych mutácií, génových mutácií a tvorby mikronukleov. Indukovaná pečeň potkanov S9 sa používa v mutačných testoch z týchto dôvodov:

Test mikronukleus (OECD 487)

Tento test detekuje tvorbu mikronukleov v bunkách, ktoré sú malé extranukleárne telieska obsahujúce fragmenty chromozómov alebo celých chromozómov, ktoré neboli začlenené do jadra počas delenia buniek. Ten mikronukleusDokáže detekovať klastogénne (chromozóm - lámanie) a aneugénne (ovplyvňujúce účinky chromozómov). Indukovaná pečeň s pečeňou S9 sa tu používa na metabolické aktivácie testovacej látky, pretože niektoré chemikálie spôsobujú chromozomálne poškodenie iba po metabolizovaní pečeňovým enzýmom. Frakcia S9 zvyšuje citlivosť testu simuláciou metabolickej aktivácie, ktorá sa môže vyskytnúť in vivo.

Chromozomálny aberačný test (OECD 473)

Tento test hodnotí, či látka môže spôsobiť štrukturálne poškodenie chromozómov indukciou zlomov, delécií, translokácií alebo iných typov aberácií. Rovnako ako test mikronukleus, ajchromozomálny aberačný testMôže sa aplikovať s metabolickou aktiváciou alebo bez nej. Indukovaná pečeň potkanov S9 sa pridá do testovacieho systému, aby napodobňovala metabolické procesy v pečeni, čo umožňuje hodnotenie látok, ktoré nemusia spôsobiť chromozomálne poškodenie v pôvodnej podobe, ale mohli by to urobiť po metabolizme pečene.

Tabuľka 1

Test HPRT/HGPRT (OECD 476)

VTest HPRT/HGPRT, Kultúry čínskeho škrečka (CHO alebo V79) alebo ľudských lymfoblastoidných (TK6) buniek sú vystavené testovacej chemikálii v prítomnosti indukovanej metabolickej zmesi pečene potkanov S9, ktorá dodáva enzýmy CYP450 potrebné na premenu pro -mutagénov na dNA -reaktívne druhy. Po krátkom ošetrení a sedemdňovom období expresie sú bunky napadnuté 6 -jtioguanínom; Prežívajú iba klony, ktoré nesú straty -funkčné mutácie v géne hypoxantín -guanín fosforibosyltransferázy. Porovnaním počtu mutantných kolónií s celkovou životaschopnosťou vedci určujú frekvenciu mutácie, ktorá, ak sa reprodukovateľne zvýši na súbežné aj historické kontroly, naznačuje genotoxický potenciál.

Testy TK (OECD 490 & OECD 476)

TenTK test používa buď myšacie lymfómové bunky L5178Y (OECD 490) alebo bunky CHO (OECD 476) Enligented heterozygotný v lokuse tymidínkinázy. Po chemickej expozícii ± S9 zmes sa bunky zotavujú a sú najúžasné v médiu obsahujúcom trifluórhymidín, ktorý zabíja bunky, ktoré sú na TK. Prežívajúce mutanty TK⁻ tvoria kolónie počas 10–14 dní, pričom mutanty s malými klastiami často odrážajú chromozomálne príhody a veľké klónne mutanty odrážajúce bodové mutácie. Rovnako ako v teste HPRT/HGPRT, prísne kontroly cytotoxicity a pozitívne referenčné hodnoty mutagénu zabezpečujú, že pozorované zvýšenie frekvencie mutácie spoľahlivo odrážajú genotoxické riziko zlúčeniny.

4. 4. Hodnotenie rizika rakoviny

Indukovaná pečeň potkanov S9 sa používa aj v štúdiách zameraných na hodnotenie rakoviny spôsobujúceho potenciál látok. Simuláciou metabolických procesov, ktoré sa vyskytujú v ľudskej pečeni, môže frakcia S9 pomôcť identifikovať zlúčeniny, ktoré by mohli viesť k tvorbe reaktívnych metabolitov schopných viazať na DNA a spôsobiť mutácie, ktoré by mohli viesť k rakovine.

Vylepšený test AMES s indukovanou pečeňou škrečka S9

Podľa najnovších usmernení vydaných Európskou agentúrou pre lieky (EMA) nemusí byť tradičný test AMES dostatočne citlivý na detekciu mutagénneho potenciálu určitých n - nitrozamínových nečistôt, najmä N - nitrosodimetylamínu (NDMA). Preto sa zlepšený test AME, ktorý vyvinula Národné centrum toxikologického výskumu (NCTR), divízia Úradu pre potraviny a liečivá USA (FDA), ako spoľahlivejšia alternatíva. Zvýšený test AMES zaviedol pridanie indukovanej pečeňovej škrečky S9, ktorá sa uskutočnila pri 30% pečeni potkanov S9 a 30% škrečkovej pečene S9. Desmozomálne supernatanty potkanov a škrečkov (S9S) by sa mali pripraviť z pečene hlodavcov ošetrených enzýmami cytochrómom p450. Použitím indukovanej pečene škrečka S9 tento vylepšený test lepšie simuluje ľudský metabolizmus a zvyšuje spoľahlivosť výsledkov.

Záver

Indukovaná pečeňová pečeň S9 slúži ako kritický nástroj pri testovaní genotoxicity a pomáha výskumným pracovníkom a regulačným agentúram hodnotiť mutagénny a karcinogénny potenciál chemikálií. Poskytovaním metabolického aktivačného systému zvyšuje schopnosť testov, ako je test AMES, testy mutácií a štúdie aktivity CYP450, na detekciu látok, ktoré vyžadujú metabolickú aktiváciu, sa stanú genotoxickými. Jeho aplikácie sú nevyhnutné na zabezpečenie bezpečnosti nových liekov, chemikálií a spotrebiteľských výrobkov. Vďaka svojej úlohe pri simulácii metabolizmu ľudskej pečene je indukovaná frakcia pečene potkana S9 naďalej nevyhnutnou súčasťou modernej toxikológie a hodnotenia regulačnej bezpečnosti.