Primárne hepatocyty: rozhodujúci nástroj na pokrok ne - Klinický výskum liekov in vitro

Primárne hepatocyty: rozhodujúci nástroj na pokrok ne - Klinický výskum liekov in vitro

Pečeň, ako primárny orgán pre expozíciu liečiva, hrá rozhodujúcu úlohu v procesoch metabolizmu liekov a toxicity. Primárne hepatocyty majú celé spektrum bunkových charakteristík a fyziologických hladín enzýmov a kofaktorov, vrátane enzýmov viazaných na membránu, ako sú napríklad cytochróm P450 (zmiešaná - funkcia oxidáza v hladkom endoplazmatickom retikule) a cytozolové esterázy, zahŕňajúce všetky metabolické trasy nachádzajúce sa v pečive. Z tohto dôvodu sa primárne hepatocyty všeobecne považujú za zlatý štandard na konštrukciu in vitro modelov pečene a sú uprednostňované vedcami v oblasti liekovej interakcie, metabolizmu liekov a štúdií toxicity. Tento článok poskytuje prehľad modelov 2D a 3D kultúry založený na primárnych hepatocytoch a ich aplikáciách vo vývoji liekov.

Kľúčové slová: primárne hepatocyty, 2D kultivácia, 3D kultivácia, organoidy, Co - kultúra.

1. 1. Izolácia primárnych hepatocytov

Izolácia primárnych hepatocytov je kritickým krokom pri vytváraní modelov pečene in vitro, pričom najbežnejšie sa používa metóda perfúznej perfúzie kolagenázy. U menších zvierat sa perfúzia pečene môže uskutočňovať prostredníctvom portálnej žily alebo dolnej vena cava, zatiaľ čo väčšie zvieratá zvyčajne vyžadujú perfúziu cez laloky alebo segmenty pečene. Úspešná izolácia hepatocytov ovplyvňuje niekoľko kľúčových faktorov: Po prvé, kolagenáza by mala byť ne - cytotoxická. Po druhé, načasovanie trávenia je rozhodujúce -Trávenie - trávenie a nadmerné trávenie môžu ohroziť výťažok a životaschopnosť hepatocytov. Po tretie, stav pečene musí byť optimálny, pretože hepatocyty sú vysoko citlivé na ischemické poškodenie. Pečeň použitá na prípravu hepatocytov by sa mala rýchlo ochladiť, aby sa znížila rýchlosť metabolizmu a zabránila metabolickej hypoxii a následnej ischémii.

Normy pre primárne hepatocyty používané pri výskume liekov sú nasledujúce:

1. 2. Primárna kultúra hepatocytov

Model hepatocytov odpruženia

Obsahuje úplné liečivo metabolizujúce enzýmy a kofaktory, vďaka čomu je vhodné na štúdium rôznych metabolických klírensových dráh. Životaschopnosť hepatocytov suspenzie a aktivita enzýmov metabolizujúcich liečiva sa však postupne znižujú so zvyšujúcim sa inkubačným časom inkubacie, čím sa obmedzuje čas inkubácie na maximálne 4 hodiny. Tento model sa zvyčajne používa na odhad klírensu liekov so strednou až vysokou mierou klírensu. Ak je miera klírensu nižšia ako 20%, nie je možné určiť presné hodnoty klírensu. Tradičné modely metabolizmu in vitro metabolizmu in vitro nie sú dostatočné na vytvorenie detekovateľných metabolických reakcií pre pomalé metabolizujúce zlúčeniny, čím obmedzujú ich schopnosť predpovedať rýchlosť klírensu a metabolické produkty týchto zlúčenín. Metóda relé hepatocytov (obrázok 1) sa môže použiť na predĺženie času inkubácie na 20 hodín alebo dokonca dlhšie.

Aplikácia:Enzýmová aktivita a štúdie metabolickej stability pre lieky s malými molekulami.

Obrázok 1. Proces prenosu prenosu prenosu hepatocytov prenosu hepatocytov

Zdroj: Drug Metab Dispos, 2012,40 (9): 1860–1865

Model platniteľných hepatocytov

Primárne hepatocyty sa kultivujú v 2D systému na kolagénových kultúrnych doskách. Hepatocyty vykazujú epitelovú morfológiu s vyčnievajúcimi jadrami, ktoré sa často vyskytujú v bvíňanej forme. Nevýhody monovrstvovej kultúry s jedným hepatocytom zahŕňajú: 1. Zmena polarity a funkcie buniek.2. Nedostatok ďalších relevantných typov buniek (t. J. Non - parenchymálne bunky), ktoré sú potrebné pre normálnu funkciu.3. Neschopnosť poskytovať dostatočné množstvo živín a parakrinných faktorov na podporu hepatocytov pri vykonávaní ich funkcií (ako je biosyntéza proteínov žlčových kyselín a sérových proteínov).

Aplikácie:

1). Hodnotenie liekových interakcií:Zahŕňa to indukciu enzýmov, inhibíciu enzýmov a štúdie transportérov. Po prvé, keď liek pôsobí ako induktor, môže to viesť k zvýšenej expresii enzýmov a transportérov metabolizujúcich liečivo. Silní induktori môžu súčasne zvýšiť viac génov, ako je fenobarbitálna indukcia CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT a niekoľko transportných proteínov, ako je MRP2. Po druhé, existujú druhy - špecifické rozdiely v tom, ako hepatocyty reagujú na induktorov. Napríklad rifampicín je účinným induktorom pre ľudské a králičie hepatocyty, ale nemá žiadny indukčný účinok na hepatocyty potkanov. Nakoniec, suboptimálna hustota pokovovania platniteľných hepatocytov môže viesť k zníženej bazálnej expresii p450 a umelo zvýšenou indukčnou reakciou. Ako je znázornené na obrázku 3, hepatocyty pri nižších hustotách pokovovania vykazujú nižšiu bazálnu aktivitu CYP1A2, CYP2B6 a CYP3A4, ale silnejšie indukčné reakcie. Preto sú na získanie fyziologicky relevantných údajov potrebné zdravé hepatocyty pri vhodnej hustote pokovovania.

Obrázok 2. Vzťah medzi hustotou pokovovania kryokonzervovaných ľudských hepatocytov a indukciou enzýmov

Zdroj: Current Discovery Technologies, 2010, 7: 188 - 198

2). Hodnotenie hepatotoxicity: Pozorovanie morfologických zmien pod svetelným mikroskopom, ako je morfológia buniek, agregácia kvapôčok vakuoly a lipidov a pripevnenie/oddelenie buniek. Detekcia nekrózy hepatocytov (ako je naznačené aspartátovou aminotransferázou, laktátovej dehydrogenázy a alanín aminotransferázy) a apoptózy (fragmentácia DNA). V prípade cytotoxicity sprostredkovanej cytokínom nemôžu jednotlivé monovrstvové kultúry hepatocytov predpovedať toxické reakcie v dôsledku regulácie látkami uvoľňovanými zo susedných ne - parenchymálnych buniek, ako sú napríklad bunky Kupffer, stelátové bunky a sínusoidálne endoteliálne bunky.

3). „Metóda relé“ na štúdium pomalého metabolizovania klírensu zlúčeniny a jej metabolitov: Aktivita liečiva metabolizujúce enzýmy v plachovateľných hepatocytoch sa začína znižovať po 24 hodinách pokovovania. Po inkubácii platniteľných hepatocytov so sérom - voľným médiom obsahujúcim zlúčeninu, ktorá je predmetom záujmu počas 24 hodín, sa médium zhromažďuje a zmieša, potom sa prenesie na nové platné hepatocyty na ďalšie štúdium (obrázok 3).

Obrázok 3. Proces prenosu prenosu prenosu prenosu hepatocytov pre prenos hepatocytov

Zdroj: Listy metabolizmu drog, 2016, 10: 3 - 15

3). Vyhodnotiť absorpciu buniek, endocytózu, endozomálny únik a umlčovacie účinky na cieľový gén hepatocytov zameraných na malé nukleové kyseliny.

Sendvičový kultivačný model

In vitro môžu byť hepatocyty kultivované medzi dvoma vrstvami kolagénu alebo Matrigelu, aby sa rekonštruovali in vivo štruktúry, známe ako sendvičové kultivácie. Hepatocyty kultivované medzi dvoma vrstvami gélového kolagénu (sendvičová štruktúra) môžu zlepšiť morfológiu a životaschopnosť buniek a udržiavať ich funkčnosť na dlhšiu dobu. Ďalej môžu hepatocyty v sendvičovej kultúre obnoviť polaritu, čo umožňuje správnu lokalizáciu bazolaterálnych a kanalikulárnych transportérov, ako aj tvorbu funkčných sietí žlčových ciest (obrázok 4).

Obrázok 4. Polarizovaná expresia transportérov v sendvičovom modeli ľudských hepatocytov

Zdroj: Current Discovery Technologies, 2010, 7, 188 - 198

Aplikácie:

1. 1). Odhad biliárneho vylučovania zlúčenín.
2. 2). Hodnotenie pečeňovej a biliárnej distribúcie endogénnych a exogénnych zlúčenín a metabolitov.
3. 3). Odhad klírens sprostredkovaný metabolizmom a transportérmi a konštrukcia farmakokinetických modelov založených na fyziológii.
4. 4). Štúdium hepatotoxicity a poskytovanie mechanizmov poranenia pečene vyvolané klinickým liekom. Údaje sú integrované do systémových farmakologických modelov na predpovedanie potenciálneho poškodenia pečene vyvolané drogami u ľudí.
5.  
   1. 3. Primárna kultúra hepatocytov

6. V systémoch 3D kultúry sa hepatocyty kultivujú v trojrozmernej matrici, ktorá lepšie napodobňuje architektúru pečene in vivo v porovnaní s 2D monovrstvami. Tieto systémy podporujú interakcie buniek a buniek a buniek - matrice, ktoré môžu obnoviť viac fyziologických funkcií pečene, vrátane metabolizmu liečiva, proteínovej sekrécie a tvorby žlčových žlčov. Primárne kultúry hepatocytov 3D sa môžu použiť na štúdium špecifických funkcií pečene v prostredí podobnom in vivo, ktoré ponúka výhody na testovanie liekov, hodnotenie toxicity a modelovanie chorôb.

   Sféroidný model

Prostredníctvom techník, ako je ultra - kultúra s nízkym pripojením, kultúra zavesenia kvapiek a kultúra magnetických buniek (obrázok 5), sa primárne hepatocyty môžu agregovať na sféroidné agregáty s priemerom až 150 - 175 µm bez toho, aby sa spoliehali na vonkajšie matrice. Jednou z výhod sféroidnej kultúry je to, že každý sféroid vyžaduje iba 1 330 - 2 000 buniek, čo významne znižuje počet buniek v porovnaní s inými technikami 3D kultúry. Nedávne štúdie ukázali, že primárne sféroidné kultúry hepatocytov sa môžu udržať až 5 týždňov, pričom enzýmová aktivita CYP zostáva takmer nezmenená medzi 8. deň 35. deň 35. Proteomická analýza odhalila, že v porovnaní so sendvičovou kultúrou, enzýmami zodpovednými za absorpciu liečiva, distribúciu, metabolizmus a vylučovanie sa lepšie konzervujú počas 14 dní v spériovej kultúre. Pečeň je však oveľa zložitejšia ako agregát buniek. Bazolaterálna strana hepatocytov interaguje s krvou, zatiaľ čo žlčová dráha vyteká z apikálnej strany, ktorá je kľúčovou črtou komplexnej štruktúry pečeňových lalokov, a to sa ešte nedá replikovať v sféroidnom modeli.

Aplikácie:

1. 1). Štúdium pomalého metabolizujúceho klírensu zlúčeniny a jeho metabolitov.
2. 2). Výskum hepatotoxicity.
3. 3). Vyhodnotenie absorpcie buniek, endocytózy, endozomálneho úniku a umlčaných účinkov na cieľové gény hepatocytov zameraných na malé lieky na nukleové kyseliny.

Obrázok 5. Metóda sféroidných kultúr

Model organoidov pečene

Konsenzuálna definícia organoidov je: 3D štruktúry odvodené z kmeňových buniek, progenitorových buniek alebo diferencovaných buniek, ktoré sú schopné reprodukovať určité funkcie a štruktúry natívneho tkaniva in vitro, čo účinne napodobňuje mikroprostredie in vivo a bunkových interakcií. Organoidy pečene boli identifikované ako najpokročilejší model výskumu biológie ľudskej pečene.

Bunkové zdroje pre konštrukciu organoidov pečene:

① Pluripotentné kmeňové bunky (PSC):

Embryonálne kmeňové bunky (ESC) a indukované pluripotentné kmeňové bunky (IPSC) majú vysokú pluripotenciu, plasticitu a neobmedzenú proliferačnú kapacitu. Pod vplyvom špecifických signalizačných faktorov sa diferencujú na bunky podobné hepatocytom s aktivitou a funkciou. Organoidy pečene odvodené z PSC môžu však podstúpiť epigenetické a genetické zmeny, ktoré vykazujú počas amplifikácie zmeny chromozomálnej aneuploidie.

Aplikácie:

1. 1). Modely genetického ochorenia pečene
2. 2). Modely infekčných chorôb pečene
3. 3). Testovanie cytotoxicity liečiva

② Bunky odvodené od pečene: Patria sem cholangiocyty a hepatocyty. Zrelé hepatocyty si zachovávajú potenciál kmeňových buniek a proliferatívnu schopnosť v konkrétnych prostrediach. V porovnaní s organoidmi odvodenými od PSC sú organoidy odvodené z primárneho tkaniva zrelejšie, so stabilnejšími genómami a udržiavajú fenotypovú a genetickú stabilitu počas dlhodobej in vitro kultúry. Dlhodobá proliferačná kapacita zrelých ľudských hepatocytov organoidov je však obmedzená v porovnaní s fetálnymi ľudskými hepatocytmi alebo primárnymi hepatocytmi pre dospelých myši. Kultivácia organoidov z hepatocytov pre dospelých zostáva náročná.

Kultúrna metóda (obrázok 6): Tkanivo pečene sa trávi do jednotlivých buniek a zmes matrigelu a buniek sa naočia do dosky 24 -, ktorá vytvára štruktúry v tvare kupoly. Inkubujte sa v inkubátore bunkovej kultúry (37 ° C) počas 15 minút. Po tuhnutí pridajte špecifické kultivačné médium. Priechod po približne 14 dňoch. Po 7 - 10 dní vymeňte pôvodné médium diferenciačným médiom.

Aplikácie:

1. 1). Modely hepatotoxicity
2. 2). Štúdie poruchy metabolizmu in vitro
3. 3). Non - Alkoholické mastné ochorenie pečene
4. 4). Vývoj liečiva pre benígne a malígne choroby pečene

Obrázok 6. Proces kultúry a priechodu tkanív odvodených organoidov pečene

Zdroj: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

Porovnanie sféroidnej kultúry a organoidnej kultúry

4. Primárny model kultúry hepatocytov

1. 1. 2D primárny model hepatocytov Co - Kultúra
      

      V 2D primárnom modeli kultúry hepatocytov sú dva alebo viac rôznych typov buniek zmiešané a kultivované v dvojrozmernom prostredí. Kľúčovou črtou tohto modelu je priama interakcia medzi rôznymi typmi buniek, interakcia medzi bunkami a extracelulárnou matricou alebo nepriamy prenos signálu prostredníctvom cytokínov a chemickej komunikácie. Primárne funkcie hepatocytov, ako je produkcia albumínu a schopnosť metabolizmu drog, sa môžu udržiavať až tri týždne.

      Aplikácie:

      1. 1). Primárne hepatocyty sú kultivované s fibroblastmi: Tento model sa používa na štúdium rýchlosti klírensu pomalých metabolizujúcich zlúčenín a ich metabolitov.
      2. 2). Primárne hepatocyty sú kultivované s ne - parenchymálnymi pečeňovými bunkami (napr. Stellátové bunky, sínusoidné endotelové bunky): tento model je užitočný na výskum poškodenia pečene vyvolané liečivom (DILI), pretože pomáha skúmať úlohu cytokínov, chemokínov a rastových faktorov pri modulácii adaptívnych odpovedí liečiva po expozícii liečiva.
      3. 3). Primárne hepatocyty sú kultivované s T bunkami: Tento model sa používa na detekciu metabolizmu liečiva pečene - Špecifické reakcie T buniek.
      4. 4). Hepatomax ™ spoločnosti IphaseCO - Kultúrny systém: IPHASE vyvinul kultivačný systém s primárnymi hepatocytmi z rôznych druhov, známy ako hepatomax™. Co - kultivovaním ľudských primárnych hepatocytov so stromálnymi bunkami je možné udržiavať dobrú aktivitu enzýmov metabolizujúceho liečivo v ľudských hepatocytoch až 3 týždne. Tento systém je vhodný na štúdium pomalých metabolizujúcich miery klírensu zlúčeniny a ich metabolitov.

      Tento model kultúry poskytuje fyziologicky relevantnejšiu platformu na hodnotenie metabolizmu drog, toxicity a chorôb súvisiacich s pečeňou, čo ponúka poznatky o tom, ako rôzne typy buniek prispievajú k funkcii a chorobám pečene.
      
      

      3D primárna hepatocytová co - Model kultúry

      Priama 3D Co - kultúra: Tento model zahŕňa zmiešanie dvoch alebo viacerých rôznych typov buniek pečene (napr. Primárne hepatocyty, sínusoidálne endoteliálne bunky, pečeňové stelátové bunky, Kupffer bunky) za vzniku samostatne zostavených sféroidov alebo ich kultivovania v 3D prostredí skonštruovaných s materiálmi, ako je kolagén, fibrín, alginát alebo hydrogény. Priama 3D co - kultúra umožňuje úzku interakciu medzi rôznymi pečeňovými bunkami prostredníctvom mechanizmov, ako je adhézia buniek - do - bunkovej adhézie, parakrinná signalizácia prostredníctvom rozpustných cytokínov a adhézia extracelulárnej matrice, čo umožňuje komunikáciu medzi hepatocytmi.

      Aplikácie:

      1. 1). Model fibrózy pečene: Používa sa na štúdium mechanizmov a progresie fibrózy pečene.
      2. 2). Model poranenia pečene vyvolané liečivom (DILI): Pomáha simulovať a hodnotiť poškodenie pečene spôsobené liekmi.
      3. 3). Drogové interakcie, metabolizmus liečiva a indukcia enzýmu: hodnotí, ako rôzne lieky interagujú, ako sú metabolizované a ako indukujú pečeňové enzýmy.

      Nepriama 3D Co - kultúra: Táto metóda používa fyzikálny separačný systém (napr. Transwell alebo iné materiály) na kultiváciu dvoch alebo viacerých typov buniek (ako sú primárne hepatocyty s bunkami NIH/3T3 alebo sínusoidných endotelových buniek) v 3D prostredí, kde sa zabráni priamemu bunkovému kontaktu. Komunikácia medzi bunkami sa vyskytuje prostredníctvom rozpustných cytokínov.

      Aplikácie:
      Používa sa na štúdium ne - kontaktnej komunikácie medzi pečeňovými bunkami v tele.

      
      Stručne povedané, IPHASE, ako líder v biologickom výskume in vitro, poskytuje komplexné riešenia pre ne - klinické testovanie liekov. Od izolácie a kultúry primárnych hepatocytov z rôznych druhov po vývoj podporných výrobkov, ako sú kultivačné médiá pre špecifické aplikácie alebo viaceré špecifikácie kolagénu potiahnuté doštičky, je spoločnosť IPHASE zameraná na ponúkanie najlepších výskumných nástrojov in vitro pre zisťovanie a vývoj liekov. Sme dôveryhodným partnerom pre klientov vo farmaceutickom priemysle a zaviazaní sa poskytovať rezné riešenia pre ne - Klinický výskum.