Fraksioni i induktuar i mëlçisë S9: Një sistem aktivizimi metabolik për gjenotoksicitetin in vitro dhe testet e mutacionit

Fjalë kyçe: OECD 471, OECD 473, OECD 476, OECD 487, Testi i mutacionit, gjenotoksiciteti, toksiciteti gjenetik, mëlçia e induktuar e miut S9, testi i ames, testi mini ames, aberracioni kromozomal, mikronukleus, hprt/hgprt, testi i TK -së

Produkt iPhase

Prezantim

Mëlçia e induktuar e miut S9është një komponent kryesor në vlerësimin etoksicitet gjenetikPotenciali i kimikateve, veçanërisht në toksikologjinë rregullatore. Zakonisht përdoret në kombinim me analizat in vitro, siç ështëTest ames dheteste mutacioni, për të vlerësuar vetitë mutagjene të komponimeve. Duke siguruar një sistem enzimatik të pasur me citokrom P450 (CYP450), fraksioni i mëlçisë së induktuar të miut S9 luan një rol vendimtar në simulimin e proceseve metabolike që ndodhin në mëlçi, duke ndihmuar në përcaktimin nëse kimikatet mund të shkaktojnë potencialisht mutacione gjenetike ose kancer.

Mëlçia e induktuar e miut S9

Fraksioni i mëlçisë S9 i referohet një postimi - Supernatanti mitokondrial i marrë nga homogjenet e mëlçisë së miut pas një seri hapash centrifugimi. Termi "i induktuar" i referohet trajtimit të minjve me komponime specifike që rrisin aktivitetin e enzimave të mëlçisë, veçanërisht enzimat e citokromit P450 (CYP450), të cilat janë përgjegjëse për metabolizmin e një game të gjerë të ksenobiotikut.

Fraksioni i induktuar i mëlçisë së miut S9 përmban një shumëllojshmëri të enzimave që janë të përfshira në fazën I dhe metabolizmin e fazës II të kimikateve. Kjo përfshin enzima të tilla si citokromi P450 monooksigjenaza, të cilat lehtësojnë biotransformimin oksidativ të substrateve, duke imituar kështu metabolizmin e mëlçisë njerëzore.

Aktiviteti CYP450 dhe aktivizimi metabolik

Familja enzimë e citokromit P450 (CYP450) luan një rol kryesor në metabolizmin e një larmie të gjerë të substancave, duke përfshirë shumë farmaceutikë, kimikate mjedisore dhe kancerogjene. Fraksioni i induktuar i mëlçisë së miut S9 përmban këto enzima dhe është thelbësore për vlerësimin e kimikateve që mund të bëhen vetëm gjenotoksike pas aktivizimit metabolik.

Shumë komponime fillimisht janë jo - toksike, por mund të bëhen toksike pas metabolizmit në mëlçi. Këto pro - mutagjene (të cilat kërkojnë që aktivizimi metabolik të bëhet mutagjenik) dhe pro - kancerogjenëve (të cilët kërkojnë aktivizim për të shkaktuar kancer) mund të zbulohen vetëm përmes analizave që përfshijnë një sistem aktivizimi metabolik S9. Pa induksionin e enzimave metabolike si CYP450, këto substanca mund të duket se janë të padëmshme në testet standarde të gjenotoksicitetit.

Duke shtuar mëlçinë e induktuar të mëlçisë S9 në analizat in vitro, studiuesit mund të vlerësojnë se si një substancë bashkëvepron me enzimat CYP450. Kjo është veçanërisht e rëndësishme për farmaceutikët, pasi metabolizmi nga enzimat CYP450 është një hap kritik në farmakokinetikën e shumë ilaçeve.

Aplikimet e mëlçisë së induktuar të miut S9

1. 1. Testi Ames (OECD 471)

Testi Ames, i përshkruar në udhëzimeOECD 471, është një nga metodat më të mira - të njohura dhe të përdorura gjerësisht për vlerësimin e mutagjenitetit. Ai përfshin ekspozimin e shtameve të baktereve të Salmonelës në një kimikate provash për të parë nëse shkakton mutacione që bëjnë që bakteret të kthehen në një histidinë - gjendje e pavarur.

Për të simuluar procesin metabolik të njeriut, mëlçia e induktuar e miut S9 shpesh shtohet në sistemin e provës. Fraksioni S9 siguron enzimat e nevojshme, përfshirë CYP450, të cilat mund të kërkohen për të metabolizuar kompleksin në një formë më reaktive që mund të shkaktojë mutacione në ADN -në bakteriale. Ky kombinim i S9 me testin AMES lejon një vlerësim më gjithëpërfshirës të potencialit mutagjenik duke imituar mekanizmat mutagjenikë të drejtpërdrejtë dhe metabolikisht të aktivizuar.

2. 2.Testet e mutacionit (Testi i Aberrimit të Kromozomit, Testi i Mikronukleusit dhe analizat e tjera in vitro)

Përveç testit AMES, testet e mutacionit zakonisht përdoren për të vlerësuar potencialin gjenotoksik të kimikateve. Këto teste janë më gjithëpërfshirëse në vlerësimin e një game të dëmtimit gjenetik, përfshirë mutacionet kromozomale, mutacionet e gjeneve dhe formimin e mikronukleve. Mëlçia e induktuar e miut S9 përdoret në testet e mutacionit për arsyet e mëposhtme:

Testi i mikronukleusit (OECD 487)

Ky test zbulon formimin e mikronukleve në qeliza, të cilat janë trupa të vegjël, ekstranuklear që përmbajnë fragmente kromozome ose kromozome të tëra që nuk janë përfshirë në bërthamë gjatë ndarjes së qelizave. test mikronukleusmund të zbulojë efektet kastogjene (kromozom - thyerje) dhe aneugjenike (duke ndikuar në numrin e kromozomit). Mëlçia e induktuar e miut S9 përdoret këtu për të aktivizuar substancën e provës në mënyrë metabolike, pasi disa kimikate shkaktojnë vetëm dëme kromozomale pasi ato të jenë metabolizuar nga enzimat e mëlçisë. Fraksioni S9 rrit ndjeshmërinë e testit duke simuluar aktivizimin metabolik që mund të ndodhë në vivo.

Testi i Aberrimit Kromozomal (OECD 473)

Ky test vlerëson nëse një substancë mund të shkaktojë dëmtim strukturor të kromozomeve duke nxitur pushime, fshirje, zhvendosje ose lloje të tjera të shmangieve. Si testi i mikronukleusit,Test i Aberrimit Kromozomalmund të aplikohet me ose pa aktivizim metabolik. Mëlçia e induktuar e miut S9 i shtohet sistemit të provës për të imituar proceset metabolike në mëlçi, duke lejuar vlerësimin e substancave që mund të mos shkaktojnë dëme kromozomale në formën e tyre origjinale, por mund ta bëjnë këtë pas metabolizmit të mëlçisë.

Tabela 1. Konsideratat krahasuese të testeve të mutacionit

Analiza HPRT/HGPRT (OECD 476)

NëVlerësim HPRT/HGPRT, kulturat e qelizave të brejtësisë kineze (CHO ose V79) ose qelizave limfoblastoide njerëzore (TK6) janë të ekspozuara ndaj kimikateve të provës në prani të një përzierje metabolike të mëlçisë së miut të induktuar, të cilat furnizojnë enzimat CYP450 të nevojshme për të shndërruar pro - sutagens në speciet reaktive të ADN -së. Pas një trajtimi të shkurtër dhe një periudhë të shprehjes shtatë -ditore, qelizat sfidohen me 6 - thioguanine; Vetëm klonet që mbajnë humbje - mutacione të funksionit në hipoxantinën - fosforibosyltransferaza të hipokantinës mbijetojnë. Duke krahasuar llogaritjet e kolonisë mutante me qëndrueshmërinë e përgjithshme, studiuesit përcaktojnë një frekuencë mutacioni që, nëse ngrihet në mënyrë të riprodhueshme mbi kontrollet e njëkohshme dhe historike, tregon potencialin gjenotoksik.

Analizat TK (OECD 490 & OECD 476)

TheProvë TK përdor ose qelizat e limfomës së miut L5178Y (OECD 490) ose qelizat CHO (OECD 476) Heterozigoz i inxhinierizuar në vendndodhjen e thymidine kinazës. Pas ekspozimit kimik ± S9 Mix, qelizat shërohen dhe janë të lyera në mesatare që përmbajnë trifluorothymidine, e cila vret qelizat e paracaktuar TK. Mbijetuar mutantët TK⁻ formojnë koloni gjatë 10-14 ditëve, me mutantë të vogël me koloni që shpesh pasqyrojnë ngjarje kromozomale dhe mutantë të madh të kolonisë që reflektojnë mutacione të pikave. Ashtu si në analizën HPRT/HGPRT, kontrollet e rrepta të citotoksicitetit dhe standardet pozitive të mutagjenit sigurojnë që rritjet e vëzhguara në frekuencën e mutacionit pasqyrojnë në mënyrë të besueshme rrezikun gjenotoksik të një kompleksi.

4. 4. Vlerësimi i rrezikut të kancerit

Mëlçia e induktuar e miut S9 përdoret gjithashtu në studimet që synojnë vlerësimin e kancerit - duke shkaktuar potencialin e substancave. Duke simuluar proceset metabolike që ndodhin në mëlçinë e njeriut, fraksioni S9 mund të ndihmojë në identifikimin e komponimeve që mund të çojnë në formimin e metabolitëve reaktivë të aftë për t'u lidhur me ADN -në dhe duke shkaktuar mutacione që mund të çojnë në kancer.

Testi i përmirësuar i Ames me brejtësi të induktuar të mëlçisë S9

Sipas udhëzimeve të fundit të lëshuara nga Agjencia Evropiane e Barnave (EMA), testi tradicional i AMES mund të mos jetë aq i ndjeshëm për të zbuluar potencialin mutagjenik të disa papastërtive të nitrosaminës, veçanërisht n - nitrosodimethylamine (NDMA), ndër të tjera. Prandaj, testi i zgjeruar i Ames, i zhvilluar nga Qendra Kombëtare për Kërkime Toksikologjike (NCTR), një ndarje e Administratës së Ushqimit dhe Barnave të Sh.B.A -së (FDA), është rekomanduar si një alternative më e besueshme. Testi i përmirësuar i Ames prezantoi shtimin e mëlçisë së brejtësit të induktuar S9, i cili performoi në përmbajtjen e 30% të mëlçisë së miut S9 dhe 30% të brejtësit të brejtësit S9. Supernatantët desmosomal të miut dhe brejtësit (S9s) duhet të përgatiten nga mëlçitë e brejtësve të trajtuar me enzimë citokrome P450 - substanca induktive. Duke përdorur brejtësi të induktuar të mëlçisë S9, ky test i përmirësuar simulon më mirë metabolizmin e njeriut dhe rrit besueshmërinë e rezultateve.

Përfundim

Mëlçia e induktuar e miut S9 shërben si një mjet kritik në testimin e gjenotoksicitetit, duke ndihmuar studiuesit dhe agjencitë rregullatore të vlerësojnë potencialin mutagjenik dhe kancerogjenik të kimikateve. Duke siguruar një sistem aktivizimi metabolik, rrit aftësinë e analizave si testi AMES, testet e mutacionit dhe studimet e aktivitetit CYP450 për të zbuluar substanca që kërkojnë aktivizim metabolik për t'u bërë gjenotoksikë. Aplikimet e saj janë thelbësore për të siguruar sigurinë e ilaçeve të reja, kimikateve dhe produkteve të konsumit. Me rolin e tij në simulimin e metabolizmit të mëlçisë njerëzore, fraksioni i induktuar i mëlçisë S9 vazhdon të jetë një pjesë e domosdoshme e toksikologjisë moderne dhe vlerësimeve rregullatore të sigurisë.