Hepatocitet parësore: Një mjet thelbësor për përparimin e hulumtimit jo - klinik in vitro të ilaçeve

Hepatocitet parësore: Një mjet thelbësor për përparimin e hulumtimit jo - klinik in vitro të ilaçeve

Mëlçia, si organi kryesor për ekspozimin e drogës, luan një rol vendimtar në metabolizmin e drogës dhe proceset e toksicitetit. Hepatocitet parësore posedojnë spektrin e plotë të karakteristikave qelizore dhe niveleve fiziologjike të enzimave dhe kofaktorëve, duke përfshirë membranën - enzima të lidhura siç janë citokromi P450 (një funksion i përzier - Funksioni në mënyrë të lëmuar në retikulën endoplazmike të lëmuar) dhe citosolikët, duke përfshirë të gjitha rrugët metabolike të faktit. Për këtë arsye, hepatocitet parësore vlerësohen gjerësisht si standardi i artë për ndërtimin e modeleve in vitro të mëlçisë dhe favorizohen nga studiuesit në bashkëveprimin e drogës, metabolizmin e drogës dhe studimet e toksicitetit. Ky artikull ofron një përmbledhje të modeleve të kulturës 2D dhe 3D bazuar në hepatocitet parësore dhe aplikimet e tyre në zhvillimin e ilaçeve.

Fjalë kyçe: hepatocitet parësore, kultivimi 2D, kultivimi 3D, organoidet, bashkë - kultura.

1. 1 Izolimi i hepatociteve parësore

Izolimi i hepatociteve parësore është një hap kritik në krijimin e modeleve in vitro të mëlçisë, me dy - metodën e perfuzionit të kolagjenazës hapin që përdoret më së shpeshti. Në kafshët më të vogla, perfuzioni i mëlçisë mund të kryhet përmes venës së portalit ose venës inferiore, ndërsa kafshët më të mëdha zakonisht kërkojnë perfuzion përmes lobeve ose segmenteve të mëlçisë. Disa faktorë kryesorë ndikojnë në izolimin e suksesshëm të hepatociteve: Së pari, kolagjenaza duhet të jetë jo - citotoksike. Së dyti, koha e tretjes është thelbësore -Të dy nën - tretja dhe mbi - Tretja mund të rrezikojë rendimentin dhe qëndrueshmërinë e hepatociteve. Së treti, gjendja e mëlçisë duhet të jetë optimale, pasi hepatocitet janë shumë të ndjeshme ndaj dëmtimit ishemik. Mëlçia e përdorur për përgatitjen e hepatociteve duhet të ftohet me shpejtësi për të zvogëluar normat metabolike dhe për të parandaluar hipoksinë metabolike dhe isheminë pasuese.

Standardet për hepatocitet parësore të përdorura në hulumtimin e ilaçeve janë si më poshtë:

1. 2. Kultura parësore e hepatociteve 2D

Modeli i hepatociteve të pezullimit

Ai përmban ilaç të plotë - Metabolizues të enzimave dhe kofaktorëve, duke e bërë atë të përshtatshme për studimin e rrugëve të ndryshme të pastrimit metabolik. Sidoqoftë, qëndrueshmëria e hepatociteve të pezullimit dhe aktiviteti i drogës - metabolizimi i enzimave gradualisht ulet ndërsa rritet koha e inkubacionit in vitro, duke kufizuar kohën e inkubacionit në një maksimum prej 4 orësh. Ky model zakonisht përdoret për të vlerësuar pastrimin e ilaçeve me norma të moderuara dhe të larta të pastrimit. Kur shkalla e pastrimit është më pak se 20%, vlerat e sakta të zhdoganimit nuk mund të përcaktohen. Hepatocitet tradicionale të pezullimit - Modelet e metabolizmit in vitro të bazuara në vitro janë të pamjaftueshme për gjenerimin e reaksioneve metabolike të zbulueshme për komponimet metabolizuese të ngadalta - Një metodë e stafetës së hepatociteve të pezullimit (Figura 1) mund të përdoret për të zgjatur kohën e inkubacionit në 20 orë ose edhe më gjatë.

Aplikimi:Aktiviteti i enzimës dhe studimet e stabilitetit metabolik për ilaçet e molekulave të vogla.

Figura 1. Procesi i transferimit të metodës së stafit të hepatociteve të pezullimit

Burimi: Metabi i drogës Dispos, 2012,40 (9): 1860–1865

Modeli i hepatociteve të pllakosura

Hepatocitet parësore janë kulturuar në një sistem 2D në kolagjenin - Pllaka të Kulturës së Veshur. Hepatocitet shfaqin një morfologji epiteliale, me bërthama të zgjatura, që shpesh paraqiten në një formë të binukleuar. Të metat e kulturës së vetme monolayer të hepatociteve përfshijnë: 1. Ndryshimi i polaritetit dhe funksionit të qelizave.2. Mungesa e llojeve të tjera të qelizave përkatëse (d.m.th., qelizat jo - parenkimale) që kërkohen për funksionin normal.3. Pamundësia për të siguruar lëndë ushqyese të mjaftueshme dhe faktorë paracrine për të mbështetur hepatocitet në kryerjen e funksioneve të tyre (të tilla si acidi biliare dhe biosinteza e proteinave në serum).

Aplikimet:

1). Vlerësimi i drogës - Ndërveprimet e drogës:Kjo përfshin induksionin e enzimës, frenimin e enzimës dhe studimet e transportuesit. Së pari, kur një ilaç vepron si një nxitës, ai mund të çojë në rritjen e shprehjes së ilaçeve - enzimat metabolizuese dhe transportuesit. Indukuesit e fortë mund të rregullojnë gjenet e shumta njëkohësisht, siç është induksioni fenobarbital i CYP2B6, CYP3A4, CYP2C9, UGT, dhe disa proteina transporti si MRP2. Së dyti, ka specie - ndryshime specifike në mënyrën se si hepatocitet i përgjigjen indukuesve. Për shembull, rifampicina është një nxitës efektiv për hepatocitet njerëzore dhe lepuri, por nuk ka asnjë efekt induksioni në hepatocitet e miut. Më në fund, densiteti i plating suboptimal i hepatociteve të pllakave mund të çojë në zvogëlimin e shprehjes bazale të P450 dhe përgjigjet e rritura artificialisht të induksionit. Siç tregohet në Figurën 3, hepatocitet në dendësi më të ulët të plating tregojnë aktivitet më të ulët bazal të CYP1A2, CYP2B6 dhe CYP3A4, por përgjigje më të forta induksioni. Prandaj, hepatocitet e shëndetshme në një densitet të përshtatshëm të plating janë të nevojshme për të marrë të dhëna fiziologjike të rëndësishme.

Figura 2. Marrëdhënia midis densitetit të plating të hepatociteve njerëzore të cryopreservuar dhe induksionit të enzimës

Burimi: Teknologjitë aktuale të zbulimit të drogës, 2010, 7: 188 - 198

2). Vlerësimi i hepatotoksicitetit: Vëzhgimi i ndryshimeve morfologjike nën një mikroskop të lehtë, të tilla si morfologjia e qelizave, grumbullimi i pikave vakol dhe lipideve, dhe lidhja/shkëputja e qelizave. Zbulimi i nekrozës së hepatociteve (siç tregohet nga aminotransferaza aspartate, dehidrogjenaza e laktatit dhe alanina aminotransferaza) dhe apoptoza (fragmentimi i ADN -së). Për citokinë - citotoksiciteti i ndërmjetësuar, kulturat e vetme monolayer të hepatociteve nuk mund të parashikojnë përgjigje toksike për shkak të rregullimit nga substancat e lëshuara nga qelizat fqinje jo - parenkimale, siç janë qelizat Kupffer, qelizat yjore dhe qelizat endoteliale sinusoidale.

3). "Metoda e Relay" për studimin e pastrimit të ngadaltë të metabolizimit të kompleksit dhe metabolitëve të tij: Aktiviteti i drogës - Enzimat metabolizuese në hepatocitet e pllakave fillon të ulet pas 24 orësh plating. Pas inkubimit të hepatociteve të pllakave me serum - medium falas që përmban përbërjen e interesit për 24 orë, mediumi mblidhet dhe përzihet, pastaj transferohet në hepatocitet e reja të pllakave për studim të mëtejshëm (Figura 3).

Figura 3. Procesi i transferimit të metodës së stafetës së hepatociteve

Burimi: Letrat e metabolizmit të drogës, 2016, 10: 3 - 15

3). Vlerësoni marrjen qelizore, endocitozën, arratisjen endosomale dhe efektet e heshtjes në gjenin e synuar të hepatociteve - ilaçe të vogla të acidit nukleik të synuar.

Model i kultivimit të sanduiçeve

In vitro, hepatocitet mund të kulturohen midis dy shtresave të kolagjenit ose matrigelit për të rindërtuar strukturat in vivo, të njohura si kultivim sanduiç. Hepatocitet e kulturuara midis dy shtresave të xhelit - kolagjenit (struktura sanduiç) mund të përmirësojnë morfologjinë dhe qëndrueshmërinë e qelizave, dhe të ruajnë funksionalitetin e tyre për një periudhë më të gjatë. Për më tepër, hepatocitet në kulturën e sanduiçit mund të rivendosin polaritetin, duke lejuar lokalizimin e duhur të transportuesve bazolateral dhe kanalikular, si dhe formimin e rrjeteve funksionale të kanalit biliare (Figura 4).

Figura 4. Shprehja e polarizuar e transportuesve në modelin e sanduiçit të hepatociteve njerëzore

Burimi: Teknologjitë aktuale të zbulimit të drogës, 2010, 7, 188 - 198

Aplikimet:

1. 1). Vlerësimi i sekretimit biliare të komponimeve.
2. 2). Vlerësimi i shpërndarjes hepatike dhe biliare të komponimeve dhe metabolitëve endogjenë dhe ekzogjenë.
3. 3). Vlerësimi i pastrimit të ndërmjetësuar nga metabolizmi dhe transportuesit, dhe ndërtimi i fiziologjisë - modele farmakokinetike të bazuara.
4. 4). Studimi i hepatotoksicitetit dhe sigurimi i mekanizmave për ilaçin klinik - Dëmtimi i induktuar i mëlçisë. Të dhënat janë të integruara në modelet e farmakologjisë së sistemeve për të parashikuar ilaçin e mundshëm - dëmtimin e mëlçisë së induktuar te njerëzit.
5.  
   1. 3. Kultura 3D e hepatociteve primare

6. Në sistemet e kulturës 3D, hepatocitet kultivohen në një matricë tre - dimensionale, e cila imiton më mirë arkitekturën in vivo të mëlçisë në krahasim me kulturat monolayer 2D. Këto sisteme promovojnë bashkëveprimet e qelizave dhe qelizave dhe qelizave - matricë, të cilat mund të rivendosin më shumë funksionet fiziologjike të mëlçisë, duke përfshirë metabolizmin e drogës, sekretimin e proteinave dhe formimin e biliare. Kulturat parësore të hepatociteve 3D mund të përdoren për të studiuar mëlçinë - Funksione specifike në një mjedis më in vivo - si mjedisi, duke ofruar avantazhe për testimin e ilaçeve, vlerësimin e toksicitetit dhe modelimin e sëmundjeve.

   Model sferoid

Përmes teknikave të tilla si kultura ultra - e ulët e lidhjes, kultura e varur nga rënia dhe kultura e qelizave magnetike (Figura 5), ​​hepatocitet parësore mund të grumbullohen në agregate sferoidale me një diametër deri në 150 - 175 μm pa u mbështetur në matricat e jashtme. Një avantazh i kulturës sferoid është se çdo sferoid kërkon vetëm 1.330 - 2,000 qeliza, duke zvogëluar ndjeshëm numrin e qelizave në krahasim me teknikat e tjera të kulturës 3D. Studimet e fundit kanë treguar që kulturat sferoide parësore të hepatociteve mund të mbajnë deri në 5 javë, me aktivitetin e enzimës CYP të mbetet pothuajse e pandryshuar midis ditës 8 dhe ditës 35. Analiza e proteinave zbuloi se, krahasuar me kulturën e sanduiçit, enzimat përgjegjëse për thithjen e ilaçeve, shpërndarjen, metabolizmin dhe ekskretimin janë të ruajtur më mirë për 14 ditë në kulturën sferoide. Sidoqoftë, mëlçia është shumë më komplekse sesa një agregat i qelizave. Ana bazolaterale e hepatociteve bashkëvepron me gjak, ndërsa biliare rrjedh nga ana apikale, e cila është një tipar kryesor i strukturës komplekse të lobulës së mëlçisë, dhe kjo ende nuk mund të përsëritet në modelin sferoid.

Aplikimet:

1. 1). Studimi i pastrimit të ngadaltë metabolizues të kompleksit dhe metabolitëve të tij.
2. 2). Hulumtimi i hepatotoksicitetit.
3. 3). Vlerësimi i marrjes qelizore, endocitozës, arratisjes endosomale dhe efekteve të heshtjes në gjenet e synuara të hepatociteve - ilaçe të vogla të acidit nukleik të synuar.

Figura 5. Metoda e kulturës sferoide

Modeli i organoideve të mëlçisë

Përkufizimi i konsensusit të organoideve është: Strukturat 3D që rrjedhin nga qelizat burimore, qelizat progjenitore, ose qelizat e diferencuara, të afta për të riprodhuar funksione dhe struktura të caktuara të indit vendas in vitro, duke imituar në mënyrë efektive mikro mjedisin in vivo dhe qelizat - në - ndërveprimet qelizore. Organoidet e mëlçisë janë identifikuar si modeli më i përparuar për hulumtimin e biologjisë së mëlçisë njerëzore.

Burimet e qelizave për ndërtimin e organoidit të mëlçisë:

Cells Qelizat burimore pluripotente (PSC):

Qelizat burimore embrionale (ESC) dhe qelizat burimore pluripotente të induktuara (IPSC) posedojnë pluripotencë të lartë, plasticitet dhe kapacitet të pakufizuar proliferativ. Nën ndikimin e faktorëve specifikë të sinjalizimit, ata dallojnë në hepatocite - si qelizat me aktivitet dhe funksion. Sidoqoftë, organoidet e mëlçisë që rrjedhin nga PSC mund të pësojnë ndryshime epigjenetike dhe gjenetike, duke shfaqur ndryshime të aneuploidisë kromozomale gjatë amplifikimit.

Aplikimet:

1. 1). Modele gjenetike të sëmundjes së mëlçisë
2. 2). Modele infektive të sëmundjes së mëlçisë
3. 3). Testimi i citotoksicitetit të drogës

② Tissue të mëlçisë - Qelizat e rrjedhura: Këto përfshijnë kolangiocitet dhe hepatocitet. Hepatocitet e pjekur mbajnë potencialin e qelizave burimore dhe aftësinë proliferative në mjedise specifike. Në krahasim me organoidet e derivuara, organoidet që rrjedhin nga indet parësore janë më të pjekura, me gjenome më të qëndrueshme, dhe ruajnë stabilitetin fenotipik dhe gjenetik gjatë kulturës së gjatë - afatgjatë in vitro. Sidoqoftë, aftësia e gjatë - afatgjatë proliferative e organoideve të pjekur të hepatociteve njerëzore është i kufizuar në krahasim me hepatocitet e njeriut fetal ose hepatocitet parësore të miut të rritur. Kultivimi i organoideve të hepatociteve të rritur mbetet sfiduese.

Metoda e kulturës (Figura 6): Indet e mëlçisë treten në qeliza të vetme, dhe një përzierje e matrigelit dhe qelizave është mbjellë në një pjatë 24 - pus për të formuar struktura kube - në formë. Inkuboni në një inkubator të kulturës qelizore (37 ° C) për 15 minuta. Pas solidifikimit, shtoni medium specifik të kulturës. Kalimi pas afro 14 ditësh. Zëvendësoni mediumin origjinal me mediumin e diferencimit pas 7 - 10 ditësh.

Aplikimet:

1. 1). Modelet e hepatotoksicitetit
2. 2). Studime të çrregullimit të metabolizmit in vitro
3. 3). Jo - sëmundje e mëlçisë yndyrore alkoolike
4. 4). Zhvillimi i ilaçeve për sëmundjet beninje dhe malinje të mëlçisë

Figura 6. Kultura dhe procesi i kalimit të indeve - Organoidet e mëlçisë të derivuara

Burimi: Cell & Bioscience (2023) 13: 197

Krahasimi i kulturës sferoide dhe kulturës organoide

4

1. 1. 2D Hepatocitet Primary Hepatocite - Modeli i Kulturës
      

      Në modelin e kulturës Hepatocite Primary Hepatocite 2D, dy ose më shumë lloje të ndryshme qelizash janë të përziera dhe të kulturuara në një mjedis dy - dimensionale. Karakteristika kryesore e këtij modeli është ndërveprimi i drejtpërdrejtë midis llojeve të ndryshme të qelizave, bashkëveprimit midis qelizave dhe matricës jashtëqelizore, ose transmetimit indirekt të sinjalit përmes citokinave dhe komunikimeve kimike. Funksionet parësore të hepatociteve, të tilla si prodhimi i albuminës dhe aftësia e metabolizmit të drogës, mund të mirëmbahen deri në tre javë.

      Aplikimet:

      1. 1). Hepatocitet parësore Co - Kulturuar me fibroblaste: Ky model përdoret për të studiuar shkallën e pastrimit të komponimeve të ngadalta - metabolizuese dhe metabolitët e tyre.
      2. 2). Hepatocitet parësore Co - Kulturuar me qeliza jo - parenkimale të mëlçisë (p.sh., qelizat yjore, qelizat endoteliale sinusoidale): Ky model është i dobishëm për hulumtimin e ilaçeve - dëmtimet e induktuara të mëlçisë (DILI), pasi ndihmon për të hetuar rolin e citokinave, kemokinave dhe faktorëve të rritjes në modulimin e përgjigjeve të adaptivit të mëlçisë pas ekspozimit të drogës.
      3. 3). Hepatocitet parësore Co - Kulturuar me qelizat T: Ky model përdoret për të zbuluar metabolizmin e ilaçeve të mëlçisë - Përgjigjet specifike të qelizave T.
      4. 4). Hepatomax i iPhaseCO - Sistemi i Kulturës: iPhase ka zhvilluar një sistem të kulturës CO - me hepatocitet parësore nga specie të ndryshme, të njohura si hepatomax-. Nga bashkëpunimi i hepatociteve parësore njerëzore me qelizat stromale, është e mundur të mbahet ilaç i mirë - aktiviteti i enzimës metabolizuese në hepatocitet njerëzore deri në 3 javë. Ky sistem është i përshtatshëm për të studiuar ngadalë - metabolizimin e niveleve të pastrimit të kompleksit dhe metabolitët e tyre.

      Ky model i kulturës CO - siguron një platformë më të rëndësishme fiziologjikisht për vlerësimin e metabolizmit të drogës, toksicitetit dhe mëlçisë - proceset e sëmundjes së lidhur, duke ofruar njohuri se si lloje të ndryshme qelizash kontribuojnë në funksionimin dhe sëmundjen e mëlçisë.
      
      

      3D Primary Hepatocite Co - Modeli i Kulturës

      CO Direct 3D - Kulturë: Ky model përfshin përzierjen e dy ose më shumë llojeve të ndryshme të qelizave të mëlçisë (p.sh., hepatocitet parësore, qelizat endoteliale sinusoidale, qelizat stellate hepatike, qelizat Kupffer) për të formuar vetë - sferoidet e mbledhura ose CO - duke i kulturuar ato në një mjedis 3D të ndërtuar me materiale të tilla si kolagjen, fibrin, alginate, ose hidrogels. Kultura e drejtpërdrejtë 3D Co - Kultura lejon ndërveprim të ngushtë midis qelizave të ndryshme të mëlçisë përmes mekanizmave si qeliza - në - ngjitjen e qelizave, sinjalizimin paracrine përmes citokinave të tretshëm dhe ngjitjes së matricës jashtëqelizore, duke mundësuar komunikimin midis hepatociteve.

      Aplikimet:

      1. 1). Modeli i fibrozës së mëlçisë: Përdoret për të studiuar mekanizmat dhe përparimin e fibrozës së mëlçisë.
      2. 2). Droga - Modeli i dëmtimit të mëlçisë (DILI) të induktuar: ndihmon në simulimin dhe vlerësimin e dëmtimit të mëlçisë të shkaktuar nga droga.
      3. 3). Ndërveprimet e drogës, metabolizmi i drogës dhe induksioni i enzimës: Vlerëson se si ndërveprojnë ilaçe të ndryshme, si metabolizohen dhe si shkaktojnë enzima të mëlçisë.

      Indirekt 3D Co - Kulturë: Kjo metodë përdor një sistem të ndarjes fizike (p.sh., transwell ose materiale të tjera) për të kulturuar dy ose më shumë lloje qelizash (siç janë hepatocitet parësore me qelizat NIH/3T3 ose qelizat endoteliale sinusoidale) në një mjedis 3D, ku parandalohet qeliza direkte - në - Kontakti i qelizave. Komunikimi midis qelizave ndodh përmes citokinave të tretshëm.

      Aplikimet:
      Përdoret për të studiuar komunikimin jo - Kontaktoni midis qelizave të mëlçisë në trup.

      
      Si përmbledhje, iPhase, si një udhëheqës në hulumtimet biologjike in vitro, ofron zgjidhje gjithëpërfshirëse për testimin jo - klinik të ilaçeve. Nga izolimi dhe kultura e hepatociteve parësore nga specie të ndryshme deri tek zhvillimi i produkteve mbështetëse siç janë media e kulturës për aplikime specifike ose kolagjen të specifikuar - Pllaka të veshura, iPhase është e dedikuar për të ofruar mjetet më të mira kërkimore in vitro për zbulimin dhe zhvillimin e drogës. Ne jemi një partner i besueshëm për klientët në industrinë farmaceutike, të angazhuar për të siguruar zgjidhje të prerjeve - Edge për jo - hulumtime klinike.